用于测量自噬通量的荧光生物传感器

由贝丝学会主席

自噬(希腊语“自我进食”)是一个细胞质材料,包括细胞器,以溶酶体为目标进行降解的过程。自噬是一个动态的过程,包括自噬体的合成、被降解到溶酶体的物质的传递以及溶酶体内部的自噬底物的降解。历史上,研究自噬的方法主要集中在计算自噬体的数量。然而,这种方法有其固有的局限性,因为它将动态过程转化为静态测量,并且它提供的关于自噬的目标材料或细胞器的信息有限。几种荧光自噬报告基因的发展现在允许测量自噬通量,或自噬活性的变化,并且是一个更可靠的自噬活性指标。这篇文章的目的是提供一个概述四种自噬生物传感器目前可用的Addgene。自噬途径

罗塞拉自噬生物传感器

罗塞拉是一种双发射自噬生物传感器,由两个串联荧光蛋白组成:相对ph不敏感的RFP变体,DsRed。伟德2021足球欧洲杯买球平台T3,它连接到ph敏感的GFP变体,超黄道荧光素(SEP)。在没有自噬的情况下,未被靶向的罗塞拉保持在中性的pH细胞质中,在那里它发出红色和绿色荧光。自噬诱导后,Rosella被定位于酵母中的液泡或哺乳动物细胞中的溶酶体。pH的降低使SEP猝灭,而DsRed不猝灭,导致只发射红色荧光。红色和绿色荧光的比例允许明确区分液泡/溶酶体和细胞质蔷薇。当与线粒体靶向序列融合时,Rosella可用于跟踪线粒体的靶向自噬,或线粒体自噬。Rosella也可以与一种蛋白质融合,以追踪该蛋白质的自噬

罗塞拉自噬生物传感器

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Keima自噬生物传感器

Keima是一种哺乳动物双发射自噬生物传感器。它对溶酶体蛋白酶的抗性是其ph依赖荧光的关键。在中性环境中,二聚体Keima在440 nm处被激发,在酸性环境中在586 nm处被激发。无论激发波长如何,Keima的发射波长为620nm。586 nm与440 nm激发的信号强度之比可以作为自噬诱导的衡量指标:Keima在细胞质中时,这个比值较低;但当Keima在自噬溶酶体中积累时,这个比率就很高。当没有靶向的时候,Keima可以用来测量整体自噬,但是添加一个线粒体靶向序列使Keima可以用于监测线粒体自噬。重要的是要记住,因为Keima的荧光依赖于溶酶体的酸性,这种生物传感器不能用于固定细胞。

Keima自噬生物传感器

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mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白

该自噬生物传感器包含与自噬相关的微管相关蛋白1A/1B轻链3B或LC3融合的mRFP和GFP。LC3是测定自噬通量的常用标记物。mRFP-GFP- lc3作为自噬生物传感器通过与Rosella相同的机制发挥作用:GFP在酸性环境中被猝灭,而mRFP相对稳定,即使在溶酶体的酸性pH值下也会荧光。因此,自噬小体的形成导致黄色斑点增多(GFF阳性/RFP阳性),当自噬小体与溶酶体融合时,这些斑点变为红色(GFP阴性/RFP阳性)。自噬增加导致黄色和红色斑点增多,而自噬体与溶酶体融合受阻导致黄色斑点增多而红色斑点减少。

mRFP-GFP-LC3串联探针

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GFP-LC3-RFP-LC3∆G:释放内部控制的荧光探针

GFP-LC3-RFP-LC3deltaG串联探针的ATG4裂解

另一个自噬生物传感器是GFP-LC3-RFP-LC3ΔG探针。它类似于mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白,但是在翻译后,这个融合蛋白被剪切,每一个rfp -标记的LC3∆G分子产生一个gfp -标记的LC3分子。

和未修饰的LC3一样,GFP-LC3是偶联的磷脂酰乙醇胺(并被招募到自噬体膜中,通过自噬导致其降解。然而,RFP-LC3∆G由于c -末端甘氨酸缺失而不能偶联到PE上,因此它作为内对照保留在细胞质中。一个食道通量由GFP / RFP比率:GFP荧光相对于RFP荧光的下降表明自噬通量增加,而GFP荧光相对于RFP荧光的增加表明自噬通量减少。

在Addgene找到GFP-LC3-RFP-LC3∆G质粒!

GFP-LC3-RFP-LC3ΔG串联调查

参考文献

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Rosado, Carlos等人。Rosella:用于报告酵母中细胞质和细胞器液泡周转的荧光ph生物传感器。自噬4.2(2008): 205 - 213。PubMedPMID: 18094608

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