使用CRISPR / CAS9生成鼠标模型

客人的博客

最后更新于2020年10月1日,阿莉娅·韦恩斯坦。

这篇文章是由客座博主秦文宁和王Haoyi。

CRISPR / Cas9正在彻底改变小鼠基因靶向场。老鼠在实验室中长期以来非常有用 - 它们相对较小,易于使用,使他们能够研究哺乳动物生物学的首选。类似于任何模型,小鼠并非没有他们的问题,但多年来使用它们积累了许多遗传和生理数据。实际上,鼠标工作的未来是光明的,因为现在使用CRISPR / CAS9来操纵鼠标基因组的更容易。

CRISPR鼠标模型

与人类的基因组相似,老鼠的基因组是由3 x 10组成的9核苷酸(NT),并编码23,000个基因。如果我们能够进入并迅速操纵单个小鼠基因并研究其在健康和疾病中的功能,但直到最近,那就太好了,但这并不容易。在20世纪80年代,发明了基因靶向技术以将具体变化引入小鼠基因组。利用这些早期技术,研究人员首先将突变引入小鼠胚胎干细胞(ESC)线,富集并选择成功掺入所需突变的细胞,然后从这些工程学的ESC中衍生小鼠。为此,将工程化escs注入开发的小鼠胚胎中,使胚胎允许开发成嵌合小鼠(在衍生自工程学的ESC的成虫小鼠中的细胞部分),并且嵌合成人配合以产生完全转基因的后代。虽然功能强大,但这种技术既麻烦使用,而不是那么高效,往往需要一年多的时间来产生鼠标模型,而且它的成功并不总是保证。

要了解更多关于这个过程的信息,请查看我们的鼠标建模博客文章:第一部分:基因工程小鼠第二部分:小鼠的繁殖和杂交

我的第一个CRISPR老鼠实验

随着2013年CRISPR的出现,一切都改变了(con, 2013) !郝毅第一次接触CRISPR是在他使用这项新技术设计小鼠模型时(, 2013,, 2013)。和世界上其他人一样,我(文宁)对CRISPR很着迷,并赶忙去测试它。我仍然记得2014年3月16日的那一天,我从一个CRISPR基因组编辑实验中得到了我的第一个初步结果。我在办公室打开了一个序列文件。然后我看到了,色谱图显示了由CRISPR引入的突变的迹象。序列一开始是干净的,然后,大约100个bps进入运行,它变得“脏”,多个序列轨迹彼此重叠!当计数完成后,这个实验中75%的老鼠出现了突变!我向窗外望去,看到了多尔山和阿卡迪亚国家公园其余的天际线。我被搞糊涂了。本来应该很难的。 I was mentally prepared to go through a learning curve that would result in success only after many attempts. Was I really successful in my first attempt at using CRISPR?

后来,我发现我的经验是世界各地的许多其他人共享的。是的,最后,我们有一个技术,CRISPR,这是简单的概念,直接使用,并且性能强劲。在其天然环境中,CrispR-Cas9是细菌和古亚群中的一种可生药的免疫系统。如果你一直在关注那样了伟德体育中心它已经被用于真核生物的基因组编辑,最广泛使用的CRISPR基因组编辑系统源自链球菌Pyogenes。替代的Cas9,来自链球菌金黄色葡萄球菌, 是与Cas9一起编辑鼠标胚胎有效年代化脓性链球菌并且具有规模较小的优势(Zhang et al., 2016)。对于基因组编辑,CRISPR / Cas系统利用3组件,导游RNA (gRNA)约125元,指定目标,创建的Cas9酶DNA双链断裂(双边带)在目标网站,和捐赠的寡核苷酸或质粒作为修复材料如果需要(敲的模型)。

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CRISPR小鼠模型基础


用CRISPR / CAS9鼠标基因组编辑过程

为了建立小鼠模型,将gRNA、Cas9和供体寡核苷酸或质粒成分放在一起,微注射到受精卵的原核或细胞质中。或者,避免接触胚胎体外,该技术被称为电穿孔进入怀孕雌性的输卵管通过输卵管核酸传递的基因组编辑或gonad(Gurumurty等,2016)。AAV也可用作载体通过注射卵母细胞或孕妇的输卵管来提供CRISPR / CAS9(Yoon等人。,2018年,Mizuno等人。,2018年)。另外,gRNA、Cas9和供体寡核苷酸可以电穿孔入小鼠受精卵(。,2015)

在受精卵内部,gRNA会在3x10中寻找其靶点9在小鼠基因组中基因含量的nt和Cas9酶将在目标位点上进行切割。当它变得兴奋时,细胞就会发出“SOS”信号,细胞修复机制就会立即修复受损的部位。如果他们能做的只是把断头缝在一起异源端加入(NHEJ),这将留下一个“伤疤”,核苷酸缺失或添加在断裂的末端,从而削弱基因。然而,如果提供了修复材料(以寡核苷酸或质粒的形式),就可以通过基因修饰对基因组进行精确的改变同源定向修复途径(HDR),是一种单一的核苷酸变化,插入报告基因,或用人类基因替换鼠序列。

使用CRISPR用于小鼠基因组工程的优点

CRISPR小鼠模型生成与常规小鼠模型生成的比较从一开始,使用CRISPR生成小鼠模型比传统方法更容易。节省时间和金钱的原因是CRISPR非常有效,你可以直接将试剂注射到受精卵中,避免了小鼠ESCs提供的富集和选择的需要。例如,在使用CRISPR生成敲除模型时,我们通常只筛选15-25只老鼠,并发现许多(如果不是全部的话)老鼠携带帧移突变。用供体寡核苷酸进行敲入,我们的目标是培育50到100只老鼠,通常都能成功培育出携带预期突变的老鼠。对于供体质粒,结果就不那么可预测了。在我们最好的情况下,我们发现3只小鼠中有2只在ROSA位点上携带了5kb的插入,这是通过Southern blot检测得到的。

从以上讨论的效率来看,与传统的方法相比,CRISPR鼠标编辑扩展了4个主要优势。首先,与传统的基因靶向技术相比,这种技术可以用于几乎所有的小鼠品系。传统的基因靶向技术仅限于少数品系,包括129和C57BL/6,我们对它们有生殖系能力的ESC品系。其次,这个过程要快得多。使用CRISPR培育创始人小鼠需要3个月,而传统的基因打靶需要8到10个月。它的成本也更低。使用CRISPR技术培育创始人老鼠的成本可能为5000美元左右,而使用传统的基因靶向技术,成本可能为5万美元。最后,与传统的基因组工程方法相比,CRISPR在产生想要的突变后代方面效率更高,使用ESC时的成功率为85%,而使用ESC时的成功率为50% (Cohen, 2016)。

看看我们最近的帖子用于小鼠中的CRISPR基因编辑的提示

使用CRISPR生成鼠标模型的缺点

虽然CRISPR难以通过NHEJ产生突变并产生与HDR产生小突变的难度,但是当涉及更大的基因组编辑时,例如用人的矫正器(大于5 kB)替换小鼠基因,它仍然可以看到是否CASPR作为常规基因靶向的稳健。最近使用CRISPR工具将25 kB人的基因引入小鼠基因组。然而,只有3.4%的创始人建立了转基因的种系传输,这种技术仍然需要改进。同样在使用CRISPR时,必须要注意并非所有GRNA都是平等的。一些比其他工作更好。在线有各种资源来指导您在GRNA设计中。我们一直在使用Benchling,但还有许多其他的可用gRNA设计工具你可以从John Doifh获得一些额外的建议GRNA设计博客帖子。最后,永远记住你是在与rna一起工作,它们容易被无处不在的RNase降解。您可能想声明您的工作台“RNase免费”,并避免与朋友和同事交谈,而工作与这些试剂。除此之外,对你的微注射员好点,他的任务很重要,就是运送有效载荷!

最后但并非最不重要的是,当使用CRISPR时,请记住这一事实,即它最初是在一种鲜为人知的细菌中发现的,而我们仍需从所有形式的生物学中学习更多!


非常感谢我们的客座博主秦文宁和Haoyi王!

温宁琴秦文宁,百健生物分子生物学家,对CRISPR应用于小鼠基因组编辑特别感兴趣。

Haoyi王王浩义,中国科学院动物研究所教授,他对利用CRISPR开发更好的人类健康治疗应用很感兴趣。

参考

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