CRISPR 101:核糖核蛋白(RNP)递送

Andrew Hempstead.

CRISPR极大地提高了科学家进行基因组改造的能力,带来了基因组工程的一场革命,新技术正在迅速发展。进行CRISPR实验至少需要交付两种成分:Cas9蛋白和靶向你感兴趣的基因组位点的引导RNA (gRNA)。这通常通过质粒转染细胞来完成,例如PX459,编码Cas9,并包含一个插入自定义gRNA的站点。虽然这种方法已经被证明对科学家非常有价值,但在使用这种方法时必须考虑一些潜在的并发症:

  1. 细胞必须易于转染或病毒转导
  2. Cas9和gRNA的表达都必须选择合适的启动子
  3. 质粒DNA可以并入基因组
  4. 随着Cas9表达时间的延长,可能会发生脱靶效应
  5. 对Cas9转录和翻译的要求推迟了编辑

什么是Cas9-gRNA核糖核蛋白?

一种可选择的方法,可以避免许多这些并发症,是直接交付核糖核蛋白(RNP),由Cas9蛋白与靶向GRNA复合物组成,对您的感兴趣的细胞。与Cas9 / GRNA的基于质粒的基于质粒的表达相比,CAS9 RNP能够以相似的效率裂解基因组靶标,并且可用于CRISPR的大多数目前的基因组工程应用,包括:产生单一或多基因淘汰赛在多种细胞类型中,基因编辑使用同源定向修复(HDR)和生成大型基因组缺失

Cas9 rnp的优势是什么?

使用RNP进行CRISPR实验有许多优点。

  • RNP方法常用于难以转染的细胞,如原代细胞。
  • 使用RNPs还可以缓解常见真核启动子(如许多CRISPR质粒中发现的CMV或EF1A启动子)不表达的细胞中出现的蛋白表达困难。
  • 因为该方法不需要递送异物DNA,并且CAS9-GRNA RNP随时间降级,使用RNP可以限制偏离目标效果的可能性。
  • Cas9 RNPs在转染后不久可检测到高水平,并通过蛋白降解途径迅速从细胞中清除。
  • 这使得Cas9 RNPs在CRISPR应用中非常有用,因为CRISPR需要有限的Cas9表达,而且需要关注特异性,比如敲除产生或同源重组。然而,需要长期表达Cas9的实验,如使用荧光团标记的dCas9可视化基因组位点可能需要使用质粒或病毒介导的传递。

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您已经决定使用rnp,现在该怎么办?

制备Cas9-gRNA核糖核蛋白

这类CRISPR实验的第一步是生成RNP复合物。虽然一种选择是从商业供应商购买Cas9蛋白和gRNA,但这通常是昂贵的。另一种方法是表达并纯化带有his标记的Cas9大肠杆菌利用质粒如pET-28b-Cas9-HisAlex Schier的实验室.gRNAs可以在体外从SSDNA转录,可以由商业供应商产生,例如踊跃参与.然后这两种成分一起孵育形成RNP。概述这些步骤的详细协议已由雅各玉米亚历克斯Schier实验室。

交付Cas9-gRNA核糖核蛋白

图中显示Cas9- grna核糖核蛋白通过电穿孔、阳离子脂质介导和Cas9蛋白携带受体配体被特定细胞类型内化

使用RNP进行CRISPR实验的优点是可用于提供CAS9-GRNA RNP的各种方法。这一优势使科学家们可以进行在体外在活的有机体内实验系统中的CRISPR研究可能不适合基于质粒的方法。

电穿孔(如图A所示)是传递RNP最常见的技术之一,它在细胞膜上产生孔洞,允许RNP进入细胞质。除了在细胞培养中使用这种技术,它也被应用于小鼠受精卵的基因组编辑,通过一个称为CRISPR-EZ (RRNP.Electroporation的Zygotes)Chen等,2016).在涉及HDR的CRISPR实验中,电穿孔可以与细胞类型的特异性试剂结合在一起,这种技术被称为核裂解,它在核膜上形成孔,允许DNA模板进入。

其他技术,例如脂质介导的转染(在上图中的B),是在发育的早期阶段。大卫刘的实验室已经证明了使用阳离子脂质介导的方法将Cas9-gRNA RNPs传递到小鼠内耳毛细胞(Zuris等人。2015年).最近描述了一种使用rnp的更有针对性的方法在体外,希望最终能将这种方法用于在活的有机体内应用程序。该技术利用Cas9蛋白携带受体配体(上图中C),从而导致Cas9-gRNA RNPs通过特定细胞类型的内在化Rouet等人,2018).这是使用Cas9突变体(Cas9M1C / C80S)来完成的,该Cas9突变体(Cas9M1C / C80s)将两种表面暴露的半胱氨酸,包括天然C547,允许连接到吡啶基二硫化物活化的配体中。

由于对作物脱靶突变和转基因整合的关注,将Cas9-GRNA RNP分配给植物作为质粒技术的另一种选择,这一直是一个紧张的研究领域。实现这一目标的两种方法是聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转染和未成熟胚胎的生物轰击(Liang等人,2017).peg介导的方法虽然在技术上不那么困难,但往往表现出低效率,而生物轰击可以有很高的效率,需要专门的设备,如基因枪。根据实验的性质,由研究人员决定哪种方法最适合给定的实验。

rnp介导的CRISPR实验的考虑

虽然在CRISPR实验中使用Cas9-gRNA rps可以减少许多潜在的并发症,但在这类实验中还需要考虑其他因素。一个重要的考虑是Cas9-gRNA RNP会随着时间的推移被细胞降解。因此,RNP介导的CRISPR实验可能不适用于需要稳定Cas9表达的实验,例如当用Cas9融合到荧光蛋白来标记核酸靶标时。而Cas9-gRNA RNPs则显示出了良好的应用前景在活的有机体内目前,对Cas9蛋白在宿主体内的免疫原性和稳定性知之甚少。事实上,研究已经表明Cas9蛋白质Geobacillus stearothermophilus在人血浆中更稳定比标准spCas9 (Harrington等人。2017年).最后,与任何科学研究一样,技术的选择通常取决于研究者对不同系统的熟悉程度。在您的实验中使用Cas9-gRNA RNPs可能需要蛋白质表达和纯化等步骤,这将需要额外的实验室试剂、设备和专业知识。

最终的想法

Cas9-gRNA RNP方法为科学家提供了一种将CRISPR组件递送到他们感兴趣的实验系统的额外手段。使用这种方法可以缓解使用质粒为基础的系统时可能出现的许多问题,尤其是在难以转染或转导的细胞中进行CRISPR研究的能力。虽然使用Cas9-gRNA RNPs可能需要在实验室中产生Cas9蛋白和gRNA,但一旦获得这些蛋白,就可以快速进行基因组编辑,在许多情况下,减少脱靶效应的机会。随着CRISPR领域的不断发展,rnp的使用很可能会在其持续发展中发挥重要作用。


亨普斯特德Andrew Hempstead是Addgene的高级科学家。安德鲁的兴趣包括基因组工程和微生物学。

参考

1.陈,肖恩,等。“通过对受精卵的CRISPR核糖核蛋白电穿孔高效的小鼠基因组编辑。”生物化学杂志(2016): jbc-M116。PubMedPMID:27151215.公共医学中心PMCID: PMC4938170

2.Zuris, John A.等。“阳离子脂质介导的蛋白质传递使得体内外高效的蛋白质基因组编辑成为可能。”自然生物技术33.1(2015): 73。PubMedPMID:25357182.公共医学中心PMCID: PMC4289409

3.Rouet, Romain等。受体介导的CRISPR-Cas9内切酶递送用于细胞类型特异性基因编辑美国化学学会杂志140.21(2018):6596-6603。PubMedPMID: 29668265.公共医学中心PMCID: PMC6002863

4.梁、珍等。“使用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物对面包小麦进行高效的无dna基因组编辑。”自然通讯8(2017):14261。PUBMEDPMID: 28098143.公共医学中心PMCID: PMC5253684

5.哈林顿,卢卡斯等人。"耐热Cas9在人血浆中寿命延长"自然通讯8.1(2017): 1424。PubMedPMID: 29127284.公共医学中心PMCID: PMC5681539

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