基因组筛选使用CRISPR

由Joel McDade.

这篇文章于2020年8月20日更新。

在您的表型中,哪些基因是重要的?许多科学家研究潜在的遗传原因并不完全知道的疾病。鉴定哪种基因对于表型很重要,可能导致丰富的额外实验,调查单个基因或整个疾病过程中的个体途径的作用。虽然CRISPR肯定不是进行所谓的“前瞻性遗传筛查实验”的第一个手段,但它肯定是最强大的。在这个博客文章中,我们将讨论如何CRISPR图书馆用于进行基因组宽的屏幕,并突出一些通过addgene公开可用的试剂。

就像这罐果冻豆一样,一个汇集的CRISPR库是一种复杂的混合物。

是什么让Crispr如此特别?

CRISPR / CAS9对先前的基因组编辑技术的主要优势是其简单性和多功能性。CRISPR / CAS9由两种组分组成:非特异性内切核酸酶(CAS9)和单链导向RNA(GRNA)。The ~20 nucleotide targeting sequence within the gRNA is defined by the user, and it can be easily modified to target Cas9 to virtually any genomic locus, provided the target is unique compared to the rest of the genome and located immediately 5’ to a protospacer adjacent motif (PAM) sequence. Co-delivery of wild-type Cas9 and a gRNA generates a double-strand break in the target DNA, which, when repaired through error-prone非同源终端连接(NHEJ),通常导致靶基因内的功能突变突变。CRISPR也可以用来启用或者靶基因而不永久性修饰基因组。如果您想刷新各种CRISPR技术,请查看Addgene'sCRISPR指南

基因范围内屏幕可用于哪些基于CRISPR的试剂?

基因组筛选实验的目的是产生和筛选突变细胞群以鉴定特定表型所涉及的基因。由于潜在的靶序列的广泛潜在靶序列和易于产生GRNA的质粒,可以容易地缩放CRISPRP.宽的筛选。CRISPR基因组宽筛选实验通常使用慢病毒将汇集的GRNA群体提供给CAS9表达细胞。汇集的慢病毒克里普尔图尔图书馆(简称为“CRISPR文库”)由含有GRNA的慢病毒转移载体的异质群组成,每个转移载体靶向基因组内的特定基因(参见图2)。设计各个GRNA在Silico.使用公共可用GRNA设计软件并合成。然后将汇集的GRNA克隆到慢病毒转移向量中以创建CRISPR库。

通过将GRNA文库与CAS9的上述衍生物组合,已经创建了CRISPR文库来灭绝,激活或抑制靶基因。几个CRISPR图书馆是公开的可通过addgene获得,更多的时间增加了请记住,图书馆只与您使用它们的实验一样好!明细的生物问题和实验系统绝对必要,以确保您选择正确的CRISPR库。

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选择适合您的CRISPR库

为您的实验选择CRISPR库时有几个因素需要考虑。

1.您的细胞源于哪种物种?目前,Addgene携带Crispr,靶向鼠标,人类,飞,E.大肠杆菌,T. Gondii.基因。

2)您想要制作什么遗传修改?Addgene携带基因敲除,激活,抑制和条形码的CRISPR文库。

3)您是否尝试靶向基因组中的每个基因,或特定的基因类别?Addgene目前带有几种基因组克里斯特库和一系列子图书馆针对特定的人类基因类

CRISPR屏幕涉及的步骤是什么?

涉及CRISPR屏幕的步骤。首先,放大CRISPR质粒文库。接下来,这个库包装到慢病毒中。然后用该病毒转导CAS9的细胞。使用下一代测序鉴定突变细胞是筛选和“命中”。使用CRISPR库进行前进遗传屏幕是一个多步骤(见图2)。在大多数情况下,以实验使用的浓度为太低的浓度提供CRISPR文库。因此,第一步是放大您的图书馆足以产生慢病毒的浓度。务必使用下一代测序检查放大的质量。如果你获得了一个立即使用的慢病毒制剂来自Addgene,您可以跳过上面的步骤!

然后用含有CRISPR文库的慢病毒转导细胞以产生异质突变细胞群,每种细胞或一组细胞含有不同基因的突变。文库可以在1质粒系统中可用,其中CAS9包括在含GRNA的质粒上,或者2-质粒系统,其中CAS9必须单独输送。

使用药物选择或荧光的细胞分选并筛选特定表型来富含突变细胞。例如,突变细胞可用于药物筛选中以鉴定赋予耐药性的基因。与未处理对照组相比,用感兴趣的药物治疗突变细胞,并在耐药性群体中分析GRNA分布。在这种情况下,“富集”的GRNA对应于在突变时赋予耐药性的基因。从这种类型的实验中的发现可以脱光,通过细胞对药物抗性的机制脱光,并且可以识别未来治疗毒性的疾病,导致不受控制的细胞生长,例如癌症。

成功屏幕的考虑和提示

下一代测序- CRISPR文库含有数千种GRNA质粒,仅通过每种质粒上的独特条形码辨别。因此,放大后和屏幕之后测序CRISPR文库需要使用下一代测序

表示- 大多数文库含有每次靶基因3-6根GRNA,并保持人口中每个GRNA的分布是关键。由于富集或耗尽特定GRNA而导致的代表丧失可能导致偏斜结果。

选择单元格类型- 理论上,任何细胞类型都可以在CRISPR屏幕中使用。然而,在突变群体内保持足够的表示需要大量的细胞作为起始材料。因此,低丰度的细胞类型并不特别适合于基因组筛选。

避免误报和假阴性- 与任何实验一样,使用适当的控制,多重重复和几种细胞类型可以加强您的结果。靶向相同基因的多个GRNA的富集或耗尽可以是强大的证据表明特定基因对给定表型实际上是重要的。应独立验证从屏幕中击中,以确保所需的修改产生您首先筛选的表型。

通过适当的实验设计和验证实践,CRISPR图书馆可以帮助您了解您的兴趣表型。有关CRISPRPRENS的更详细信息,请查看Addgene的2016 Publication“使用汇集的慢病毒CRISPR图书馆的实践考虑因素“(McDade等人。,2016)。要了解如何在其他类型的实验中使用CRISPR / CAS9,请查看我们的CRISPR质粒和资源页面


参考

McDade JR,WaxMonsky NC,Swanson Le,Fan M(2016)使用汇集的慢病毒CRISPR图书馆的实际考虑因素。分子生物学115的当前方案:。https://doi.org/10.1002/cpmb.8.

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