从你的慢病毒转导中获得最多

由梅根·“政府改造”

慢病毒是一个强大的实验室工具,经常被用来建立稳定表达感兴趣的基因的细胞系。虽然使用慢病毒(感染和选择)的一般方法看起来很简单,但实际上,许多人发现使用慢病毒费时、困难,而且缺乏可重复性。请继续阅读一些技巧,以最大限度地利用你的慢病毒转导实验。

提高病毒产量的方法:频繁传代,监测生长速率,遵循SOP

爱你的细胞,它们也会爱你

一个成功的慢病毒感染始于你的细胞,包括你的包装细胞和你的目标细胞。不良的组织培养做法会导致低浓度和穷人转导。细胞系的常规传代培养密度应低到足以防止融合,但高到足以促进细胞生长。过度培养刺激静止期,即细胞周期的静止期;静止细胞不吸收核酸或表达转基因以及积极分裂细胞导致较低的慢病毒滴度。

另一个要考虑的因素是你的文化解冻后的年龄。一般来说,传代次数越高,转染和转导效率越低。培养物只应通过20-30次,然后丢弃和解冻一个新鲜的瓶子。在许多实验室中,由于缺乏文档和实验室人员的高周转,存储细胞的历史可能有点可疑。如果您不确定正在使用的线条的背景,最好从头开始。从信誉良好的经销商获得所需细胞系的小瓶,如美国式文化收藏尽可能多的冷冻早期试管。

一个经常困扰实验室并阻碍实验的问题是支原体污染。支原体污染已证明来自各种来源,如血清、其他细胞系或受感染人员,并可持续存在而不被发现;与酵母菌、真菌或细菌等较大微生物的感染不同,支原体水平达到10时,很难检测到8培养基混浊前每毫升细胞数。支原体与宿主细胞争夺营养,并能发生改变表达式受体,离子通道和生长因子导致的改变细胞系增长和行为。支原体污染的迹象可能是微妙的,可能包括饱和密度降低,生长速度下降,或结块。为确保组织培养实验的最佳结果,实验室应常规检测支原体污染。有几个商用支原体检测试剂盒使用检测细胞系、ELISA、荧光测定法或基于pcr的方法来检测低水平的污染。对于那些喜欢更经济的检测模式的实验室,'等。概述一个自己做它基于pcr的方法完整的免费提供的阳性对照。

定期检测你的细胞系是否有支原体,如果培养物过于混合或太老就丢弃它。确保你正在与健康、快乐的细胞一起工作是提高病毒生产和感染的最简单方法之一。

伟大的转导始于伟大的病毒

如果拥有快乐细胞是成功的慢病毒感染的第一步,那么快乐病毒就是第二步。在收集慢病毒时,一些实验室喜欢从多个时间点收集和集中收获,而另一些实验室则在转染转移和包装质粒后选择一次收获。多重收获策略的一个好处是,每天你都可以为生产者提供新鲜的培养基。每天进行培养基交换有助于缓解由于培养物的高细胞密度引起的pH值变化和资源消耗引起的细胞应激。除了有利于你的细胞外,培养基交换也可能影响你收获的慢病毒颗粒的质量。研究已经证明渗透压和pH值的极端变化可以破坏病毒包膜的稳定。多重采集方法的一个缺点是,它往往导致低滴度病毒的体积更高。在这种情况下,你可能需要考虑集中病毒准备

储存也可以在慢病毒转导的成功过程中发挥作用。冻融循环对慢病毒稳定性的影响取决于多种因素,如表达的转基因、使用的病毒存储缓冲液以及其他实验参数。例如,虽然通常不推荐冻融,光明战记et al。发现pH值为6时产生的慢病毒能够抵抗多次冻融循环。因此,除非绝对必要,否则最好避免冻融慢病毒制剂。许多实验室试图将新收集的慢病毒用于下游应用。虽然这可以确保使用最高滴度的病毒,但并不总是可行的,特别是当慢病毒原液需要滴定时。如果保存时间少于一天,慢病毒可保存在4°C.对于长期储存,病毒制剂应分成一次性的等分,并在-80储存°一些报告建议快速冷冻病毒干冰/乙醇在储存前先用浴液或液氮。

了解你的目标细胞

实验室倾向于遵循与慢病毒感染相同的一般程序,产生病毒,滴度病毒(阅读这篇博客的技巧滴滴你的慢病毒制剂)和感染。虽然这种方法是成功感染的良好开端,但需要考虑的一点是病毒是如何滴度的。大多数滴度方法都能转导到高许可细胞系,如HEK293、H0或A549,并认为这些细胞系的结果可以转译到其他细胞系中。然而,不同细胞类型的生理差异可能使这一假设不正确。慢病毒转导最早的步骤之一是病毒包膜和靶细胞表面受体之间的相互作用。慢病毒可能的相互作用和可能的靶点由包膜蛋白决定。很多时候慢病毒载体是用非天然的包伟德BV下载膜改造的,这个过程叫做pseudotyping。带有VSV-G包膜蛋白的拟型慢病毒使用低密度脂蛋白受体感染细胞并有广泛的宿主范围。然而,病毒准型与其他包膜蛋白可能有有限数量的目标,因此在一种细胞类型中获得的效价可能不能很好地转译到其他细胞类型。为了克服这个问题,试着用一系列稀释度的慢病毒制剂进行转导。希望通过使用更浓的稀释度,你能够克服受体表达的差异。

都是混合在一起的

甚至在慢病毒包膜蛋白附着到细胞表面受体之前,感染过程中还发生了其他重要的结合事件。这些结合事件可被负电荷细胞与病毒的静电斥力所破坏。为了避免这个问题,传导通常使用带正电荷的聚阳离子,聚烯。有趣的是,一项研究发现诸如deae -葡聚糖等替代聚物可以提高转导效率。此外,本研究发现,转导效率不仅在不同厂家的血清之间存在差异,而且在同一来源的不同批次血清之间也存在差异。常规生产慢病毒的实验室可能需要考虑测试各种阳离子和血清来源,以确保最佳的转导。

是一致的

一旦您的实验室为特定的应用建立了最佳的条件,坚持使用它们!变化细胞密度、体积、孵育时间和MOI等变量都能影响慢病毒感染的成功与否。为确保高质量和可重复的结果,请始终正确照顾您的细胞系和病毒,并在遵循方案时保持一致。

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