伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白-正确连接

客人的博客

本文由客座博客Joachim Goedart撰稿,Joachim Goedart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和先进显微技术van Leeuwenhoek中心的助理教授。

用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质以研究其功能是荧光蛋白最常用的应用之一。伟德2021足球欧洲杯买球平台这些融合蛋白使观察活细胞和生物体中的蛋白质成为可能。嵌合体的两个组成部分都是由DNA编码的。由于研究人员可以以他们喜欢的方式产生几乎任何DNA序列,融合蛋白的设计和工程相对简单。然而,在保持蛋白质固有特性的同时产生融合是一项挑战。在这篇博客中,我讨论了产生融合蛋白的策略,并强调了它们设计的一些方面。

mTurquoise晶体结构蛋白质的大小和形状很重要

来自的绿色荧光蛋白Aequorea victoria它的变体是基因编码的荧光探针。其中的一个限制是GFP的大小:~240个氨基酸或约28kda。GFP及其同系物具有β -桶结构。尽管β桶对其他蛋白质没有很强的亲和力,但由于它的大小,它仍然可能阻碍被标记蛋白质的功能或活性。这种类型的干涉称为空间位阻。例如,GFP可能会封闭催化位点或阻碍翻译后修饰所必需的结合位点或基序。尽管存在这些潜在的问题,GFP已经成功地应用于无数融合蛋白。

选择单体蛋白质,避免粘在一起的情况

其次是尺寸,潜在的均二聚和更高的顺序荧光蛋白的低聚化伟德2021足球欧洲杯买球平台是一个问题。荧光蛋白的低聚倾向被称为“粘性”。伟德2021足球欧洲杯买球平台由于荧光标记应该作为一个惰性的发光模块,任何GFP同质二聚的倾向都应该避免,因为它会使蛋白质的大小翻倍。此外,它增加了亲和力,因为它使每个单位的结合位点数量翻倍。

有几种方法测量粘性在体外,超离心或凝胶过滤是最常见的分析方法。然而,这些可能不能反映细胞内的情况。因此,关键融合(如微管蛋白或连接蛋白)的定位被用作二聚化的代理(Shaner等人,2008-补充图C)。然而,这些分析是定性的。有组织平滑内质网(OSER)测定法(Costantini等人,2012)根据OSER轮状结构的外观,测量了靶向于质粒内网的FPs的同源二聚。这种方法是定量的,目前是评估细胞寡聚化的标准。

除了测量粘性,一些研究人员还收集了荧光蛋白特性的数据,如亮度,耐光性、成熟时间和各种荧光蛋白的酸敏感性(伟德2021足球欧洲杯买球平台Botman等人,2018年;Cranfill等人,2016;兰伯特,2019)。这些特征很重要,但不如粘性重要。根据我的经验,在哺乳动物细胞中作为单伟德2021足球欧洲杯买球平台体的荧光蛋白包括:mTurquoise2、mEGFP、mNeonGreen、mScarlet(-I)和mCherry。

保持链接序列短

在GFP应用的早期,许多人关注荧光蛋白的空间位阻。因此,科学家开始在目标蛋白和荧光蛋白之间使用相对较长的连接物。它们要么是(i)由多个克隆位点编码,因此由随机氨基酸序列组成,要么是(ii)设计成惰性的、非结构化的肽,因此由甘氨酸、丝氨酸和其他小的、非脂肪族氨基酸组成。然而,长连接体增加了融合蛋白被蛋白酶裂解的机会。

如今,有了足够的结构信息,很明显,荧光蛋白的c端来源于伟德2021足球欧洲杯买球平台Aequorea victoriaGFP伸出来,可以被认为是连接体(图1)。事实上,对于几个FRET生物传感器(黄色变色3.60,EPAC,Galphai),可以截断供体荧光蛋白的c -末端和n -末端,以提高FRET效率。

在你感兴趣的蛋白质的N端和C端创造融合

APT mVenus蛋白融合最直接的融合蛋白是通过连接荧光蛋白和感兴趣蛋白(POI)的N-或c -末端制成的。为了表示这个序列,人们经常使用像“c端融合”这样的术语,但我发现这非常令人困惑,因为这可能意味着荧光蛋白在POI的c端,或者POI在荧光蛋白的c端。我更喜欢描述融合的不同部分从N端到c端。例如,Lifeact-mTurquoise2 (质粒# 36201)或红细胞微管蛋白(质粒# 85045)。

我们经常使用限制性内切酶在多个克隆位点产生融合。对于poi荧光蛋白融合,我们的经验是4个氨基酸的连接子(PVAT,当我们在多个克隆位点使用AgeI位点时)就足够了。对于荧光蛋白- poi融合,我们产生没有任何连接的直接融合。

当两个方向都可用时,直接比较这些融合蛋白可以揭示哪一个更好地保留POI的功能。例如,APT1-mVenus融合定位于高尔基体,而mVenus-APT1融合不定位(图2)。在mVenus-APT1中,高尔基体定位所需的脂质基元被阻塞,因此该蛋白定位错误。APT1-mVenus聚变显然是一个更好的选择。

在你想要的蛋白质中插入荧光蛋白

我们已经遇到了几种POI的N端和c端对其固有性质是必要的蛋白质。在这种情况下,由于荧光蛋白的N端和c端残基相对靠近,将荧光蛋白插入到POI中可以很好地工作(图1)。

荧光蛋白应该插入哪里?那些不太可能破坏POI结构的位点是最好的。理想情况下,结构信息可以指导这个决策。根据我们的经验,插入的最佳位置是二级结构(beta-sheet或alpha helix)之间的一个环。另外一个要求是插入位点不能与其他蛋白质或生物分子相互作用。成功插入荧光蛋白的例子是标记Ccd42 (Bendezú等人,2015)和异三聚体g蛋白的α亚基(Janetopoulos等人,2001,Adjobo-Hermans等人,2011)。

虽然结构信息可以指导设计,但建议使用不同的插入生成多个构造,因为很难预测哪一个如图3所示(Mastop等人,2018)。无偏置的随机插入可以用基于转座子的策略生成(谢里登,2002)。

人类Galpha13 mTurquoise

避免蛋白质过表达

编码融合蛋白的DNA的引入将蛋白质添加到细胞内现有的蛋白质池中,并可能导致过表达的人工制品。这是该技术的一个重要缺点,在解释结果时应该始终考虑到这一点。

最近基因组编辑方法的革命(最显著的是CRISPR / Cas HDR介导的)使内源基因标记接近本机表达式级别。然而,建议首先表达基于质粒的融合蛋白,以评估嵌合体是否仍然具有功能。

关于荧光蛋白融合的最后一点

在生成融合蛋白之前,有几个选择需要考虑,例如连接子长度,特定的荧光蛋白变体,以及在哪里添加荧光标记。这些选择将决定融合反应所标记的天然蛋白功能的程度。融合蛋白的定位可以被验证,它可以与基于免疫荧光或蛋白质特性的预期结果相比较。

确定功能的其他方面(催化活性或相互作用)是很有挑战性的。如果融合可以补充敲除或敲除相应蛋白质,这就是融合表现良好的有力证据。但这并不是决定性的证据,表明融合的运作方式与天然蛋白相同。尽管荧光蛋白融合可能永远不能与未标记的蛋白质作用相同,但能够看到感兴趣的蛋白质的好处通常超过标记潜在的负面后果。


非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhart!

Joachim_100pxJoachim Goedhart是分子细胞学和Van的助理教授列文虎克高级显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发、鉴定并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart

参考文献

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