伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白-正确连接

客人的博客

这篇职位由Guest Blogger Joachim Goedart,该职位是分子细胞学和van Leeuwenhoek中心(阿姆斯特丹大学)的助理教授。

用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质以研究其功能是荧光蛋白最常用的应用之一。伟德2021足球欧洲杯买球平台这些融合蛋白使观察活细胞和生物体中的蛋白质成为可能。嵌合体的两个组成部分都是由DNA编码的。由于研究人员可以以他们喜欢的方式产生几乎任何DNA序列,融合蛋白的设计和工程相对简单。然而,在保持蛋白质固有特性的同时产生融合是一项挑战。在这篇博客中,我讨论了产生融合蛋白的策略,并强调了它们设计的一些方面。

mturquoise水晶结构蛋白质尺寸和形状很重要

来自的绿色荧光蛋白(GFP)来自Aequorea victoria它的变体是基因编码的荧光探针。其中的一个限制是GFP的大小:〜240个氨基酸或约28kDa。GFP及其同源物具有β-桶结构。虽然β筒对其他蛋白质没有强烈的亲和力,但由于其尺寸,它仍可能阻断标记蛋白的功能或活性。这种类型的干扰被称为空间障碍。例如,GFP可以咬合催化位点或阻塞后翻版修饰所需的结合位点或基序。尽管存在这些潜在问题,但GFP已成功使用无数融合蛋白。

选择单体蛋白并避免粘性情况

其次是尺寸,潜在的均二聚和更高的顺序荧光蛋白的寡聚化伟德2021足球欧洲杯买球平台是一个问题。荧光蛋白对低聚的倾向被称为“粘性”。伟德2021足球欧洲杯买球平台由于荧光标签应该作为惰性发光模块操作,因此应避免任何GFP到同型偶发过化的趋势,因为它将增加蛋白质的大小。此外,它增加了耐酸性,因为它可以加倍每单位的结合位点的数量。

有几种方法测量粘性在体外,超离心或凝胶过滤是最常见的分析方法。然而,这些可能不能反映细胞内的情况。因此,关键融合(如微管蛋白或连接蛋白)的定位被用作二聚化的代理(Shaner等人。,2008年-补充图C)。然而,这些分析是定性的。有组织平滑内质网(OSER)测定法(Costanti et al。,2012年)根据OSER轮状结构的外观,测量了靶向于质粒内网的FPs的同源二聚。这种方法是定量的,目前是评估细胞寡聚化的标准。

除了测量粘性,一些研究人员还收集了荧光蛋白特性的数据,如亮度耐光性、成熟时间和各种荧光蛋白的酸敏感性(伟德2021足球欧洲杯买球平台Botman等人,2018年;Cranfill等,2016年;兰伯特,2019)。这些特征很重要,但优先于粘性较少。在我的经验中,表现为哺乳动物细胞中的伟德2021足球欧洲杯买球平台单体的荧光蛋白包括:mturquoise2,Megfp,mneongreen,mscarlet(-i)和mcherry。

保持链接器序列短

在GFP应用的早期,许多人关注荧光蛋白的空间位阻。因此,科学家开始在目标蛋白和荧光蛋白之间使用相对较长的连接物。它们要么是(i)由多个克隆位点编码,因此由随机氨基酸序列组成,要么是(ii)设计成惰性的、非结构化的肽,因此由甘氨酸、丝氨酸和其他小的、非脂肪族氨基酸组成。然而,长连接体增加了融合蛋白被蛋白酶裂解的机会。

如今,具有充足的结构信息,很明显荧光蛋白的C-末端衍生自伟德2021足球欧洲杯买球平台Aequorea victoriaGFP伸出来,可以被认为是连接体(图1)。事实上,对于几个FRET生物传感器(黄色变色3.60埃佩克,百麦),可以截断供体荧光蛋白的c -末端和n -末端,以提高FRET效率。

在你感兴趣的蛋白质的N端和C端创造融合

APT mVenus蛋白融合最直接的融合蛋白是通过连接荧光蛋白和感兴趣蛋白(POI)的N-或c -末端制成的。为了表示这个序列,人们经常使用像“c端融合”这样的术语,但我发现这非常令人困惑,因为这可能意味着荧光蛋白在POI的c端,或者POI在荧光蛋白的c端。我更喜欢描述融合的不同部分从N端到c端。例如,Lifeact-mTurquoise2 (质粒#36201)或mscarlet-timulin(质粒#85045)。

我们经常在多个克隆部位中使用限制酶来产生融合。对于POI-荧光蛋白融合,我们的经验是4个氨基酸的接头(PVAT,当我们在多克隆部位使用龄位点)就足够了。对于荧光蛋白 - POI融合,我们产生直线融合,没有任何接头。

当两个方向都可用时,直接比较这些融合蛋白可以揭示哪一个更好地保留POI的功能。例如,APT1-mVenus融合定位于高尔基体,而mVenus-APT1融合不定位(图2)。在mVenus-APT1中,高尔基体定位所需的脂质基元被阻塞,因此该蛋白定位错误。APT1-mVenus聚变显然是一个更好的选择。

在你想要的蛋白质中插入荧光蛋白

我们遇到了几种蛋白质,其中POI的N-和C-末端是其天然性质所必需的。在这些情况下,由于荧光蛋白的N-和C-末端残基相对靠近(图1),因此将荧光蛋白的插入孔可以很好地工作良好(图1)。

荧光蛋白应该插入哪里?不太可能破坏POI结构的网站将最为努力。理想情况下,结构信息可以指导这一决定。在我们的经验中,插入的最佳网站是次结构(Beta-Shore或Alpha Helces)之间的环路。另外的要求是插入部位不会与其他蛋白质或生物分子相互作用。成功插入荧光蛋白的实例是CCD42的标记(Bendezú等人,2015)和异络型G-蛋白的α亚基(Janetopoulos等人,2001Adjobo-Hermans等人,2011)。

虽然结构信息可以指导设计,但建议使用不同的插入生成多个构造,因为很难预测哪一个如图3所示(Mastop等人,2018)。无偏置的随机插入可以用基于转座子的策略生成(Sheridan,2002年)。

人类Galpha13 mTurquoise

避免蛋白质过表达

编码融合蛋白的DNA的引入将蛋白质添加到细胞内现有的蛋白质池中,并可能导致过表达的人工制品。这是该技术的一个重要缺点,在解释结果时应该始终考虑到这一点。

最近基因组编辑方法的革命(最显著的是CRISPR / Cas HDR介导的)使内源基因标记接近本机表达式级别。然而,建议首先表达基于质粒的融合蛋白,以评估嵌合体是否仍然具有功能。

荧光蛋白融合的最终词汇

在生成融合蛋白之前,有几个选择需要考虑,例如连接子长度,特定的荧光蛋白变体,以及在哪里添加荧光标记。这些选择将决定融合反应所标记的天然蛋白功能的程度。融合蛋白的定位可以被验证,它可以与基于免疫荧光或蛋白质特性的预期结果相比较。

确定功能的其他方面(催化活性或相互作用)是很有挑战性的。如果融合可以补充敲除或敲除相应蛋白质,这就是融合表现良好的有力证据。但这并不是决定性的证据,表明融合的运作方式与天然蛋白相同。尽管荧光蛋白融合可能永远不能与未标记的蛋白质作用相同,但能够看到感兴趣的蛋白质的好处通常超过标记潜在的负面后果。


非常感谢我们的嘉宾Blogger,Joachim Goedhart!

Joachim_100pxJoachim Goedhart是分子细胞学和Van的助理教授列文虎克高级显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发、鉴定并使用基因编码的荧光探针。你可以在twitter上关注他:@joachimgoedhart

参考文献

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