哈弗兰肯机构,一个可视化单分子和新生肽的新型成像工具

由Alyssa Cecchetelli.

部件稳定支架,部分表位结合区域,全部融合到荧光蛋白。“弗兰肯达人”就像臭名昭着的弗兰肯斯坦一样,是通过嫁接不同的零件。通过组合两个抗体探针的优化元素,现在可以更容易地可视化单个分子和新形成的蛋白质。

GFP在成像中的限制

虽然GFP一直是一种学习蛋白质的强大强大的工具体内它确实有一些局限性。GFP具有长蛋白质成熟时间,限制其用于成像蛋白质的整个生命周期的用途。这使得科学家几乎不可能使用GFP进行图像新生蛋白质。此外,GFP标签大,暗淡,永久地连接到蛋白质中,使它们难以扩增和长时间的图像。

是基于抗体的探针吗?

为了解决这些限制,科学家们具有用于标记目的的共选择抗体。不同抗体结合不同的蛋白质序列,称为表位,科学家可以使用这些来标记其感兴趣的蛋白质。抗体基探针,例如抗原结合片段(Fabs)(搬运工1959.) 和单链可变碎片(SCFV)(Inbar等人,1972年)融合到成熟的荧光团,可以染色和亮起表位标记的蛋白质体内。然而,这些探针可能是昂贵的,难以递送到生活系统中,并且通常不会在细胞内部妥善折叠一次。

开发哈兰肯等

将这些抗体的探针与这些抗体的问题进行打击Stasevich Lab.使用替代策略来开发遗传编码的基于抗体的探针,该探针检测各种细胞环境中广泛使用的HA表位。他们叫这个探究哈弗兰肯(赵等人。,2019年)。

为了开发HA Frankenbody,Stasevich实验室测试了几种SCFVS支架,先前被证明可以折叠和在活细胞中起作用。为了使这些特定于不同目标的支架,科学家们将它们融合给称为识别和结合特异性表位的抗体的互补确定区域(CDR或环)的序列(Ewert等人,2004年)。该SCFV杂交机提供探针结构和来自支架的稳定性,以及朝来自CDR的HA表位的特异性。

为了使标记为HA表位的蛋白质,实验室将荧光蛋白融合给杂交抗HA SCFV。添加荧光蛋白允许科学家在活细胞中探测结合时容易观察标记的蛋白质。

在他们的概念实验证明中,Stasevich实验室观察到GFP的Colecalization用MCHERRY,4xHA标记的组蛋白(H2B)在U2OS细胞中。然后,他们表明,哈弗兰肯体探针还可以结合1xHA标记的组蛋白,以及标记的线粒体蛋白意大利面条怪物哈(SMHA)包含10xha标记。这些实验表明,HA弗兰肯体可用于放大荧光信号体内成像:10xHA标签将荧光信号提高到1×HA标签上的五倍折叠。

HA Frankenbody用蛋白质定位的示意图最后,研究人员发现,HA Frankenbody在生活神经元等敏感细胞中有效,并且可以融合到其他荧光蛋白质和标签,包括MCHERRY,HALOTAG和SNAP标签伟德2021足球欧洲杯买球平台多色成像

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你还能用哈弗兰肯机构做什么?

HA Frankenbody的另一个大优势是,活细胞中的几分钟内容仍然是HA表位,这意味着科学家可以随着时间的推移跟踪单个HA标记分子的运动和定位。

Stasevich Lab还证明了HA Frankenbody可以有效地用于跟踪U2OS细胞中的单个mRNA翻译。HA很小,只有9个氨基酸,因此它被核糖体快速翻译。此功能提供了HA Frankenbody的能力,该功能将新生HA标记的蛋白质结合。

最后,哈弗兰肯体可以用于整个生物体的成像。研究人员使用HA Frankenbody在80分钟的时间课程中成功地在开发的斑马鱼胚胎中跟踪核。

通过将稳定的支架和HA结合区域缝合在一起,Stasevich实验室创建了一种通用工具,可用于可视化各种蛋白质动态体内。将来,这种拼接技术可以应用于其他表位和脚手架,以建立更强大的FrankenBodies。


参考

埃夫特,S.,Honegger,A.,&Pluckthun,A.(2004)。细胞外和细胞内应用抗体的稳定性改进:CDR移植到稳定的框架和基于结构的框架工程。方法34.(2),184-199。PubMed.PMID:15312672

Inbar,D.,Hochman,J.,&Givol,D。(1972)。抗体组合位点的定位在重链和轻链的可变部分内。美国国家科学院的诉讼程序69.(9),2659-2662。PubMed.PMID:4560694。PubMed Central Pmcid:PMC427010

Porter,R.(1959)。兔Y-球蛋白的水解和抗体与结晶木瓜蛋白酶。生物化学杂志73.(1948),119-126。PubMed.PMID:14434282。PubMed Central Pmcid:PMC1197021。

赵,N.,Kamijo,K.,Fox,P. D.,Oda,H.,Morisaki,T.,Sato,Y.,... Stasevich,T. J.(2019)。用于在体内成熟和成熟的HA标记蛋白的成像的遗传编码探针。自然通信10.(1)。PubMed.PMID:31270320。PubMed Central Pmcid:PMC6610143。

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