热质粒- 2020年8月

通过各种Addgenies

火焰每隔几个月,我们通过我们的热质粒的文章。这些文章提供了最近质粒沉积的简要总结,我们希望它们能让你更容易地找到和使用你需要的质粒。如果你想写关于最近的质粒存款请签名在这里

以下是你会在这篇文章中看到的内容:



酵母蛋白进化后的催化速度更快

通过乔安妮·卡门

马特奥桑切斯和爱丽丝Ting利用一种生物技术工具优化另一种。作者创造了一个基于酵母的定向进化方法有一些显著的改进。定向进化技术模拟序列的自然选择,进化出蛋白质可测量的特性。作为一种概念证明,Sanchez和Ting试图提高烟草腐蚀病毒蛋白酶(TEV)的催化效率,这是一种用于切割的高度序列特异性的蛋白酶亲和标签从纯化的重组蛋白在小和大规模。

这项新技术涉及到细胞质(而不是在酵母胞外表面)的选择,使跟踪蛋白酶活性荧光蛋白-不需要亲和纯化!该团队使用其他分子技术引入TEV裂解的时间调制,并提高了该系统用于低亲和变异TEV的效用。新系统已被证明可用于其他目标蛋白的进化,并可能对您的研究有用。

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酵母FACS进化平台示意图
产生TEV蛋白酶变种的进化平台示意图。TEV蛋白酶的催化作用允许转录因子进入细胞核,调节mCitrine基因的转录。mCherry是构成式表达。然后细胞被培养和FACS分类。图片来自Mateo Sanchez和Alice Ting。

Sanchez MI等人,Nat方法。2019.https://doi.org/10.1038/s41592-019-0665-7


优化标记哺乳动物细胞结构和隔间的荧光工具

通过安吉拉Abitua

基因编码的荧光蛋白常被用于标记细胞内生物伟德2021足球欧洲杯买球平台分子的特定结构、隔间或特定定位。然而,有时这些荧光蛋白可能无法定位到正确的位置,这伟德2021足球欧洲杯买球平台可能会提供误导信息,使人们知道一个结构或蛋白质在细胞内的确切位置。Goedhart实验室、Gadella实验室及其合作者正在努力改进基因编码荧光标记,以标记细胞内的特定结构。

已标记HeLA细胞的显微镜图像
用编码FPs的质粒转染HeLa细胞,质粒标记来自p63(1-29)和Lck的质膜靶蛋白序列。从图片Chertkova等人,2020年

在他们的BioRxiv帖子,作者生成并描述了几种改进的基因编码荧光标记物,标记为mTurquoise2、mNeonGreen和mscarlett - i,用于标记细胞内的一系列特定结构。例如,为了改善荧光蛋白的核定位,他们发现添加三个核定位信号或包含与Histone 2A或2B的融伟德2021足球欧洲杯买球平台合可以导致明亮的靶向表达,同时最小化非特异性标记。为了标记质膜,他们测试了不同的目标序列以提高选择性,发现最好的基序来自于Lck基因。在标记哺乳动物细胞微管时,作者发现这些标记物的高表达会导致非特异性标记。他们生成了EB3标记的质粒来标记微管的生长尖,以及MapTau标记的质粒来标记整个微管。

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Chertkova, AO等,bioRxiv。2020.https://doi.org/10.1101/160374


纳米体——有一个简单的方法!

通过米歇尔·克罗宁

的好处nanobodies传统的抗体不能被忽视。与抗体相比,纳米体体积更小,更持久,通常更容易克隆、表达和纯化。纳米体很容易在细胞质中表达大肠杆菌然而,纳米体蛋白质往往会被卡在包涵体中。岩垣隆行、原纪美子和梅村一雄都有描述了一种简单的方法缓解包涵体问题,使纳米体生产大肠杆菌就像遵循DNA迷你准备协议一样简单!

首先,作者通过修改创建了pMAK骨架pMAL-T-Avi-His / BirA,矢量常用于在活的有机体内通过BirA和AviTAG进行生物素化。pMAK包含MBP的信号肽,然后是所需的纳米体(NB)序列,一个AviTAG和6xHis标签。MBP信号肽允许NB被输出到细菌的周浆,在那里它可以分泌到上清。在pMAK中生成了四个含有不同纳米体(NB)的质粒:

pMAK461-64质粒在SHuffle T7 Express competent中表达大肠杆菌(NEB)采用IPTG归纳。为了对纳米体进行生物素化,作者使用了溶解在DMSO中的生物素,这使得生物素和生物素-4-荧光素都能以更高的浓度溶解,并导致均匀的NB生物素化。通过Ni-NTA磁珠一步固定化金属离子吸附层析(IMAC),可以很容易地纯化NBs。

pMAK461-64的纳米体生产流程
纳米体表达和纯化的工作流程。

Iwaki等人,Protein Expr Purif, 2020。https://doi.org/10.1016/j.pep.2020.105607


一种新的多路复合CRISPRi和CRISPRa系统用于人类多能干细胞

通过云顶娱乐 韦德国际

CRISPR基因干扰(CRISPRi)和基因激活(CRISPRa)是通过特定的引导RNA (gRNA)序列来调节几乎任何基因表达的好方法。但这些方法都依赖于dCas9和gRNA的持续表达。这种表达方式会因转基因设计和传递的不同而显著变化。

为了克服人类多能干细胞(hPSCs)中的这些变异,林迪舞巴雷特的实验室博德研究所开发的荧光标记技术piggyBac带菌者,制服和持续单一或多组gRNAs表达及dCas9融合。利用AAV1将dCas-KRAB激活因子和dCas-VPR抑制因子引入hPSC基因组,并包含一个EGFP报告因子。人多能干细胞中dCas9-KRAB激活因子或dCas9-VPR抑制因子的表达也受到强力霉素诱导启动子的驱动。gRNA piggyBac质粒包括一个mRFP报告基因。有了这个系统,他们可以量化和追踪同时表达dCas9和gRNAs的细胞。

质粒与基因组整合图。多grna piggyBac载体利用piggyBac转座酶整合到基因组DNA中。用杀虫素选择整合子。
多grna piggyBac载体在piggyBa转座酶的帮助下整合到基因组DNA中。从图片Hazelbaker等人,2020年

实验室通过抑制和激活TCF4的表达,同时监测转录本和蛋白水平来测试该系统。质粒的多路复用piggyBacgRNA交付和一体化dCas9-KRABdCas9-VPRAddgene可发现靶向质粒。

检查这些质粒piggyBac gRNA传递和全合一dCas9靶向质粒!

Hazelbaker等人,《科学报告》,2020。https://doi.org/10.1038/s41598-020-57500-1


CRISPR角

通过云顶娱乐 韦德国际

以下是近期CRISPR质粒的一些亮点。要找到Addgene提供的所有CRISPR质粒,请访问我们的CRISPR质粒和资源页面

  • PAC-MAN(人类细胞中预防性抗病毒CRISPR)是一种基于CRISPR-Cas13的抗病毒方法降解SARS-CoV-2序列和甲型流感活病毒的RNA。它被证明在人类肺上皮细胞中起作用。
  • 用于植物的MoClo CRISPR/Cas工具包包括95个质粒,包括CRISPR/Cas核酸酶、碱基编辑器、gRNA骨干和在单子叶和双子叶中表达的启动子。
  • CRISPR RNP电穿孔和AAV供体感染(CRISPR- readi)使基因组工程使用成为可能HDR捐赠者的长度为4.9 kb
  • 一个新的dual-deaminase基本编辑器使腺嘌呤和胞嘧啶同时编辑。
  • 合成生物学的一个新工具CRISPRi控制基因表达。这包括基于crispri的合成振荡器、双稳态网络、条带图案形成的非相干前馈环路。

新病毒服务

通过在人

我们定期从我们的质粒收集中添加新的病毒分株以提供现成的病毒预备。以下是最近几个月的一些新的病毒准备:

  • GPCR激活的去甲肾上腺素(GRABNE)传感器允许对去甲肾上腺素进行敏感和高时空测量。这些去甲肾上腺素传感器包括GRAB_NE1h(高亲和性)和GRAB_NE1m(中亲和性),以及GRAB_NEmut作为阴性对照。
  • 黄色荧光蛋白钙传感器,钙指示剂jGCaMP7的变体,为激发波长超过1,000纳米,并使红色荧光蛋白钙传感器双色成像。这些新的钙传感器包括syn-jYCaMP1s(慢变体)、依赖于crea的syn-FLEX-jYCaMP1s和轴突靶向的syn-FLEX-axon-jYCaMP1s。
  • 新血清型PHP中依赖crep的EYFP AAV。V1显示出高效的脑泡细胞转导。
  • 新的血清型Cre-dependent Flpo重组酶pEF1a-DIO-FLPo-WPRE-hGHpA,现在也可以在AAV5和AAVrg中使用。
  • 新的控制,生物传感器,化学遗传和光遗传AAV前脑伽马氨基丁酸能中间神经元的表达。其中包括mDlx-GFP, hDlx-FLEX-GFP, hDlx-Flex-dTomato, mDlx-GCaMP6f, hdlx - gidread - dtomato和mDlx-ChR2-mCherry。


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