热质粒:基于fret的生物传感器

由肯德尔摩根

Addgene公司Griesbeck实验室基于freet的生物传感器奥利弗Griesbeck马克斯·普朗克神经生物学研究所(Max Planck Institute for Neurobiology)的研究人员从钙和其他小分子的基因编码指示物开始,就一直致力于该领域的研究。这些工程传感器的设计是为了取代自上世纪80年代以来一直在使用的合成钙染料。

“合成染料是该领域的标准染料,但有一个问题:如何使其进入感兴趣的细胞,”Griesbeck说。因为它们是化合物,它们必须被涂抹或注射,它们并不总是在你想要的地方结束。

Griesbeck对监测活神经元的活动和生物化学特别感兴趣,试图理解分子水平和细胞水平的事件和行为之间的联系。他认为这是“神经科学中最大的挑战之一”。

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热质粒:抽搐传感器

Griesbeck最近在该领域的贡献是一系列基于荧光共振能量转移(FRET)的钙生物传感器。也许最值得注意的是推奇钙传感器,这是可在Addgene,可用于比率在活的有机体内成像。Griesbeck解释道,虽然这些Twitch传感器总是明亮的,但是当它们在钙的存在下从“关闭”转变为“打开”时,它们就会改变颜色。这种颜色的变化可以在显微镜下观察到使用市售分束器。除了对神经元进行成像,Griesbeck补充说,这种颜色的变化对于观察正在运动的细胞(如T淋巴细胞)内发生的事件具有特殊的优势。

Griesbeck和他的同事们开始从肌细胞中分离钙结合蛋白——肌钙蛋白C (TnC)。他们鉴定了一种对钙结合具有高亲和力的蟾蜍TnC变异,并开发了这种变异一种具有尽可能少的钙结合位点以增加敏感性的蛋白质版本。

在报道自然方法,这些Twitch传感器变体的FRET变化通过在细菌的大规模功能屏幕上测试各种连接器配置进行优化。然后,在大鼠海马神经元培养中通过二次筛选改进传感器变异。优化后的Twitch传感器让研究人员可以看到神经元中的紧张动作电位和高分辨率的T淋巴细胞功能跟踪,也使它们产生在神经科学和免疫学中应用的一个通用工具

不要害羞:比率成像适合初学者

Griesbeck表示,他的钙指标可以用于小鼠,果蝇,秀丽隐杆线虫,还有斑马鱼,基本上所有的标准生物都有广泛的基因工具。虽然他认识到一些初学者可能倾向于回避比率成像,但他建议他们尝试一下。

“初学者有时觉得它很复杂,但实际上它很好,”他说。“它提供的信息比基于强度的读数更多。”

Griesbeck还指出了他和他的同事们采用的方法优化灵敏度现在可以应用于其他数十个已发布的基于freet的传感器。例如,他的团队现在正在应用它来改进他们开发的一个指标在2010年出版用于观察活细胞中的转录因子camp响应元件结合蛋白(CREB)。

“现在我们做得非常好,”Griesbeck说。“我们知道CREB真的很重要,但它真正重要的地方和时间?”这还不得而知。”

过渡金属

Maarten Merkx艾恩德霍芬理工大学的研究人员对基于freet的传感器蛋白也有类似的兴趣,特别是对过渡性金属离子(如锌、铜和铁)的胞内成像。

“这些是必需的金属离子,但它们也是有毒的,”Merkx解释说。需要新的工具来测量它们。

Merkx说,w虽然原则上,采用FRET传感器来监测钙和锌应该需要简单的结合域交换,但在实践中,传感器的优化需要大量的试验和错误。过渡金属也面临挑战,因为它们在细胞中被发现时的浓度比钙低得多,需要更高的敏感性。

他和他的同事们想出了一个解决办法:他们设计了自结合荧光域,这些荧光域的结合在配体存在时被破坏(它们以一种状态粘在一起,而不是另一种状态)。

他说:“这是制造具有大动态范围的FRET传感器的一种相当稳健的方法。”Merkx最近将这种“技巧”应用于开发额外的颜色变异。这导致了redCALWY-1,红移烦恼传感器锌利用mOrange2和mCherry的变体作为供体和受体结构域。他说,这些新的颜色现在可以用来观察不同分子之间的相互作用,比如锌和钙。

最终,Merkx说他希望其他人会发现他的工具是有用的,包括他的锌传感器和他的基因编码镁传感器美国是第一个这样的国家。

Merkx说:“我希望通过在Addgene存钱,人们会开始使用它们。”“对我们来说,这是衡量成功的主要标准之一- - - - - -我们是否真的开发了一些有用的东西(足够)让其他人开始使用。对我们来说,这就像一场测试。”

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