热质粒- 2020年6月-条形码CRISPR文库,稀疏细胞标记,钙调神经磷酸酶报告,DNA染色替代

由各种addgenies.

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人类全基因组sgRNA iBAR文库

文章供稿人苏珊娜Bachle

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图1:使用sgRNA进行crispr聚合筛选的初始步骤IBar.。从图片朱等人,2019

文胜威的实验室北京大学的一名研究人员开发了一种新的CRISPR筛选方法,该方法利用环状区域内带有内部条形码(iBARs)的引导rna。用sgRNA感染细胞后IBar.包含慢病毒载体的库可以通过下一代测序来检测IBA伟德BV下载R。

为了避免高误率发现率,传统的CRISPR屏幕在细胞库构造期间需要低多个感染(MOI),以确保大多数细胞接受一个GRNA。即使在高分多种感染时使用,IBAR方法也产生高质量的数据,因为该设置允许为每个GRNA进行实验性复制。该想法是将四个不同的条形码分配给每个GRNA并嵌入GRNA序列内的这些条形码。这使得通过计算GRNA及其IBAR序列来允许在同一实验中多次追踪每个GRNA的性能。自从SGRNA.IBar.该文库覆盖了所有已注释的人类基因,可实现MOI高的全基因组筛选,有利于减少细胞和细胞内的数量体内设置。

找到sgRNAIBar.图书馆!

朱等人,基因组生物学,2019。PubMedPMID: 30678704


使用重组酶比赛稀疏细胞标记

文章供稿人读经文温斯坦

通过重组酶竞争的稀疏预测活性(SPARC)是一种完全遗传工具,用于标记遗传定义的细胞子集的一小部分。通过标记群体中更少的细胞,更容易看到个体/不重叠的细胞。到目前为止,这些工具都是劳动密集型的,需要使用诸如注射AAV精确滴定或热休克有机体等操作。

SPARC系统利用竞争重组位点选择性地去除一个效应/报告基因上游的停止盒。在停止盒被移除的细胞中,效应器被表达。通过将结构中的一个重组位点截断到不同长度,标记细胞的密度可以改变为密集(45%标记细胞)、中间(12%)和稀疏(4%)水平。

SPARC是一种多功能系统,可以在许多细胞类型和生物中使用,包括果蝇,鱼和小鼠,通过用您正在学习的细胞的感兴趣的基因取代效应。读我们SPARC博客文章为更多的细节。

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图2:钙指示剂GCaMP6f在果蝇视叶中的密集(c)、中间(d)、稀疏(e)标记。从图片Isaacman-Beck等人,2019

开始使用稀疏标记

Isaacman-Beck等人,bioRxiv 2019。https://doi.org/10.1101/788679


酵母中对钙皮林活性的不稳定GFP报告者

文章供稿人利亚Schwiesow

钙突素是一种蛋白质磷酸酶,其响应细胞内的细胞内钙水平上升。当CA的水平2 +在细胞中高,钙粘蛋白去磷酸盐蛋白CZI,其又与钙素依赖性响应元素(CDRES)结合并驱动基因表达。因为钙皮林是致病性真菌的毒力所必需的,因为它是一种有吸引力的药物靶标。钙皮林记者允许科学家来测量钙碱动力学,可以作为药物筛选平台,以识别靶钙素尿素的新抗真菌。

目前钙调磷酸酶基因报告基因是基于细菌βgal检测,不适合高通量筛选、钙调磷酸酶动态测定或监测体内。为了克服这些技术问题,塞布丽娜Buttner的实验室设计了一种由迅速降级的破坏性的GFP变体组成的煅烧霉素转录记者,融合到4倍CDRE重复。除了表明该载体适用于流式细胞术和荧光显微镜,它们还表明该方法与使用碘(PI)的死池染色相容,允许在应激或老化细胞群中进行钙碱活性测量。

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图3:野生型(顶面板)和具有高细胞内Ca2 +(底部面板)的细胞的显微照片,其配备了不稳定的GFP钙调解素报告器(蓝色)并用PI(粉红色)染色以表明细胞死亡。从图片Diessl等,2020年

在这里找到GFP报告钙调神经磷酸酶活性

Diessl等,《微生物细胞》,2020年。https://dx.doi.org/10.15698%2Fmic2020.04.713


截断的tale -荧光蛋白融合物作为DNA染色染料

文章供稿人云顶娱乐 韦德国际

双链DNA被tTALE-FP与荧光蛋白荧光绿色结合图
图4:具有Ttale-FP的双链DNA与荧光蛋白荧光绿色。从图片Shin等人,2019年

为dna -蛋白质相互作用研究寻找一种插入荧光染料的替代方法?Kyubong乔的实验室与tTALE产生荧光蛋白融合以“染色”DNA。TALE蛋白质可以结合特定的DNA序列,将附着的荧光蛋白带到DNA上。他们创造了用于纯化tTALE-eGFP和tTALE-mCherry的质粒。

与能引起光诱导的DNA断裂和结构变形的插层荧光染料相比,这些探针是可逆的并且不会引起结构变形或光致损伤。这些融合还可以在高盐条件下起作用 - 高达100毫米NaCl。这些Ttale-FPS还具有较高的DNA结合亲和力与富含40mM至100mM NaCl的富含GC的区域与GC富含区域。均匀含有1倍的缓冲液。该实验室还在单个分子荧光测定中使用Ttale-FP,以实时监测单分子的限制酶消化。

发现表达Ttale-FP的质粒

Shin等人。,SCI。代表2019年。https://doi.org/10.1038/s41598-019-53722-0


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