热质粒- 2019年3月-抗crispr, 2in1克隆,荧光电压指标和光开关蛋白

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听这一集的热质粒!

CASANOVA对CRISPR-Cas9的光遗传控制

文章提供的卡里谷

podcastRssButton_TJF_2016_9_14 -01 (3)听听反crispr的播客部分

反CRISPR卡萨诺瓦抗CRISPR (Acr)蛋白能有效抑制II型CRISPR系统,包括流行的链球菌Cas9 (Rauch等人,2017年,海因斯等人,2017年)。然而,Acr抑制在空间和时间上都是普遍存在的,这使得它们成为控制CRISPR的一个相当钝的工具。为了更好地控制Acr作为生物工具的活动,Niopek同事们转向光遗传学。通过利用光敏蛋白结构域,他们已经发展出一种系统来使用蓝光控制CRISPR-Cas9的活性(Bubeck等人,2018年)。

他们通过插入一个感光的LOV2域来实现这一点答:漂白亚麻纤维卷进入Acr蛋白吖啶a4的环状区域。在黑暗中,吖啶a4抑制CRISPR活性。随着蓝光的加入,LOV2结构域的末端螺旋被打开,破坏了蛋白的构象,从而抑制了Acr的功能。这允许CRISPR-Cas9在其目标上发挥作用。他们将最有效的Acr-LOV融合蛋白抑制剂CASANOVA命名为“CRISPR-Cas9活性通过一种新的光遗传突变crisia4切换”。CASANOVA对蓝光反应迅速。在CASANOVA复合物失活的几分钟内,荧光CRISPR复合物被观察到结合端粒DNA。卡萨诺瓦有什么优点?它适用于链球菌Cas9, dcas9效应器融合,和xCas9,不需要额外的化学物质或修改。这种多功能性开辟了空间和时间控制的潜力,在许多基因靶向和编辑实验。

在这里找到CASANOVA质粒!

Bubeck F等人,《自然方法》2018。PubMedPMID: 30377362


利用荧光电压指示器研究神经元活动

文章提供的Shreya Vedantam

podcastRssButton_TJF_2016_9_14 -01 (3)听电压指标播客部分

大脑中的神经元通过电脉冲来协调情感、思想和行为。历史上,科学家通过将电极插入大脑来研究脑电活动。但这个过程既耗时又昂贵。因此,科学家们转向了基因编码的电压指示器。

为了扩展电压指示器工具箱,Ed Boyden的实验室开发了一种方法来快速筛选数千种蛋白质,其中一种可以通过成像报告电活动。他们将光敏蛋白QuasAr2进行系统突变。通过使用机器人选择方法来选择他们想要的具有不同特征的细胞,该团队确定了Archon1,一种基于视蛋白的新型荧光电压指示器。执政官1可以将自己嵌入细胞膜,这样细胞电压就可以被测量。Archon1具有亮度高、定位性好、信噪比高、灵敏度高、响应快、光稳定、与光遗传控制兼容等特点。研究人员还表明,执政官1号在很多动物模型中都有功能,比如老鼠,C线虫,斑马鱼。

在Addgene找到执政官1质粒!

Piatkevich KD等人,Nat Chem Biol 2018。PubMedPMID: 29483642

指向演变导致电压指标执政官1


利用2in1载体克隆系统使蛋白质-蛋白质相互作用研究更容易

文章提供的米歇尔·克罗宁

podcastRssButton_TJF_2016_9_14 -01 (3)请听2in1克隆播客片段

最近,Grefen实验室引入“2in1”载体克隆系统-一种Gateway兼容的方法,可以同时将两个感兴趣基因(GOI)克隆到一个质粒上的两个独立表达盒(Grefen和Blatt, 2012)。类似的传统网关™克隆,印度政府首先需要克隆到一个入口向量。2in1克隆系统包含两个输入向量(pUC57-L1L4pUC57-L3L2提供使用的好处限制消化克隆在2in1向量中引入GOIs而不是GatewayTM克隆BP反应,即通过重组插入GOI。

2in1载体蛋白的克隆纯化

2in1克隆系统非常适合于依赖农杆菌瞬时转染系统的植物中的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)研究烟草benthamiana拟南芥(邢等人,2016))。在农杆菌介导的DNA转移过程中,每个GOI通常从不同的质粒中表达,这可能导致不同的基因剂量和蛋白质共表达的高变异性。通过引入含有两种GOIs的质粒,可以更均匀地控制表达水平。Grefen实验室利用2in1克隆系统生成了一系列质粒用于PPI的研究Förster共振能量转移(烦恼,Heckler等人,2015年)或比值双分子荧光互补(rBiFC, Grefen and Blatt, 2012)。的2 in1质粒工具包包含4个质粒工具包,由4个不同的二进制2in1向量生成,所有可能的标签取向组合(NN、NC、CN和CC)。这4个试剂盒还包含两个进入载体pucl - l1l4和pucl - l3l2。

在Addgene找到2in1质粒试剂盒!

Mehlhorn DG等,方法,Mol Biol, 2018。PubMedPMID: 29043675
格雷芬C和布拉特先生。2012年生物学技术。PubMedPMID: 23066669
Hecker A等,植物生理学2015。PubMedPMID: 25971551


发现用于光可切换蛋白cPYP和AsLOV2的新的蛋白结合工具

文章提供的安吉拉Abitua

podcastRssButton_TJF_2016_9_14 -01 (3)请听可光转换蛋白质播客部分

可逆控制的光可转换蛋白,改变蛋白构象响应光,提供了一种空间和时间控制细胞过程在活的有机体内。自然界中存在许多光活性蛋白,但将它们开发成光基因工具可能很困难,因为这需要详细的蛋白质结构知识。为了克服这个挑战,乌帕拉帕蒂和伍利实验室开发了一种噬菌体展示技术,使用小支架蛋白识别新的结合蛋白,结合光可切换cPYP的光态和暗态,响应蓝光(445nm),构象改变。发现和应用只与光或暗状态的可光切换蛋白质结合的蛋白质伙伴提供了一个强大的方法来控制细胞中的蛋白质相互作用,因为蛋白质结合物可以定制为蛋白质可视化、迁移、降解、修饰和支架。

在他们的研究Woolley实验室的研究表明,这些光可逆的蛋白质-蛋白质相互作用可以控制亚细胞定位过程在活的有机体内。他们把由此产生光遗传质粒工具其中包括编码cPYP和tgRFP融合的质粒(PLL7.0 tgRFP cPYP),编码蛋白质结合物(结合于光或暗状态的可光切换蛋白质)的质粒融合到与线粒体定位序列TOM20 (pTriEX Tom20 mVenus BoPD)。在表达这些质粒的暗适应细胞中,tgRFP荧光定位于线粒体,因为cPYP与BoPD结合。一组类似的新鉴定的光和暗结合质粒工具也被用于可切换AsLOV2。

光控制蛋白定位光遗传学

在这里找到cPYP和AsLOV2蛋白结合质粒!

Reis JM等。ACS合成生物学,2018 PubMedPMID: 30203962


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主题:热质粒

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