干冰如何影响病毒载体样本的pH值&如何避免

由Leila Haery

Leila Haery.

我们一直在想办法改进我们的运输过程。在阅读一个出版物,描述了干冰上的短期术语如何移动样品pH值,我们想知道我们在运输期间用来冷冻病毒的干冰是否对样品有影响。因此,我们设计了一些实验来确定我们的管子是否能渗透到CO2从干冰中释放,这是否会影响病毒样品的pH值。阅读,了解含水样本可能会受到干冰的影响,以及如何干冰如何影响干冰病毒从Addgene

底线有好消息,也有坏消息。坏消息是一些管的o形环实际上是可渗透的有限公司2在低温下(-80°C)和一旦进入管有限公司2可以改变液体样品的pH。好消息是这种效果是可逆的,可以防止pH转变。如果您计划在干冰上运送某些东西,或者如果您在干冰上接受样品,请记住此信息 - 它可能会阻止您看到一些意外结果。

准备使用来自addgene的病毒准备

测量样品的pH值:我们所做的

为了测量我们的样品的pH值,我们使用了一种细胞培养基溶液,该溶液经过缓冲,并含有pH指示剂酚红。我们将样本冷冻在-80°C的冰箱中,然后将它们转移到一个封闭的干冰储存容器中48小时(以复制病毒的运输方式),在那里,它们将暴露在一个封闭的环境中有限公司2(来自干冰)。48小时后有限公司2/干冰储存,然后我们将样品在室温下解冻,并使用液体溶液的颜色和pH纸以测量pH值。我们将干冰储存样品与仅储存在-80°C冰箱中而不是暴露在一起的控制中有限公司2/干冰。所有样品均检测一式两份。

干冰对病毒载体样本pH值的影响

我们发现

并不是所有的管(或者说不是所有的o形环)都可以渗透有限公司2在低温下。我们测试了两种不同类型的管:我们用于存储的管慢病毒还有我们用来存储的那些AAV。我们的结果表明,一旦解冻,就没有对储存在我们的慢病毒管中的样品的pH没有影响(图1)。然而,一旦解冻,在我们的AAV管中储存的样品的pH值就会大幅减少(从7.4到5.0)(图1)。

值得注意的是,pH值的变化只发生在溶液解冻时,如有限公司2当样品冷冻时被限制在管顶空间。这是通过在解冻时样品界面上可见的pH逐渐变化的清晰(图2)。在解冻之前,所有样品都是如颜色所示的0.4的对照pH pH值(数据未显示)。

我们接下来做的是:排出管子

然后我们测试了在解冻之前排出管有限公司2从头部空间,因此减轻干冰储存的pH效应。为此,我们在干冰上储存样品72小时,然后通过完全移除管道排出管瓶盖,将试管直立孵育30秒,然后在解冻前盖上试管。我们将通气管和非通气管与未暴露于干冰的对照组进行了比较。

发泄有帮助吗?

我们发现30秒的通风减弱了干冰储存引起的pH变化(图3)。然而,30秒并不足以阻止任何pH值的变化,因为我们仍然观察到pH值的轻微变化(从7.4到6.8)。有可能更长的排气时间将足以使样品返回到原始pH值。

以及对pH值的影响

把它放回冰箱怎么样?

然后,我们测试了这些试管在干冰上储存后,是否可以放回-80°C的冰箱有限公司2离开管子,并会阻止在解冻时改变pH(图4.)。为了验证这一点,我们将试管冷冻在-80°C,然后将它们移到干冰上封闭储存48小时。然后,我们将试管移回-80°C的冰箱中,在0到96小时之间进行不同的恢复时间。我们将这些样品与仅保存在-80°C的对照样品进行了比较。然后,我们在规定的孵育期后将试管解冻,并测量pH值。

我们发现经过至少96小时的恢复时间的管具有与从未储存在干冰/暴露于干燥冰上的对照管相同的pH值有限公司2(图5)。基本上,有限公司2进去和有限公司2熄灭了。

冰箱储存效果对pH结论及处理建议

并不是所有的o型环在-80°C时都能最佳发挥作用。对于用干冰运输的样品,这会影响样品的pH值,这可能会对样品的含量有一些影响。例如,一项研究发现干冰储存影响了抗体的性能,由于pH对蛋白质稳定性的影响(Murphy等,2013)。然而,一旦管被打开并恢复与环境空气的平衡,我们解决方案的pH变化是瞬态的并且恢复正常。我们没有证据表明pH的瞬态变化会影响AAV功能。此外,另一项研究在一系列pH曝光后测试AAV感染性。他们表明,AAV感染性不会通过短2小时暴露于低至2.5(Potter等,2014)的低2小时暴露而改变。他们还表明,甚至24小时暴露于pH5.1没有改变病毒的感染性。然而,在暴露于pH 5.1的3周后,感染率的显着降低(Potter等,2014)。

基于我们的结果和其他报道的结果,我们建议一旦您从Addgene获得AAV,您将AAV在-80°C保存96小时,然后解冻。然而,如果这是不可能的,我们建议在解冻前至少放30秒气管,并在24小时内使用解冻的病毒。


参考

1.在干冰上运输或储存后的蛋白质不稳定性。2013年4月,10(4):278-9。PubMedPMID: 23538862

2.作者简介:Potter M, Lins B, Mietzsch M, Heilbronn R, Van Vliet K, Chipman P, Agbandje-McKenna M, Cleaver BD, Clément N, Byrne BJ, Zolotukhin s。Mol Ther Methods Clin Dev. 2014 Aug 13;1:14034。PubMedPMID:26015974。公共医学中心PMCID:PMC4420252

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

更多资源请访问Addgene.org

下载病毒载体101电子书伟德BV下载

主题:伟德BV下载,Addgene病毒服务

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅