用外来AAV改善转导效率

由克劳斯Wanisch.

标准AAV载体由生产的细胞系产生,如广泛使用的293T。中矢量生产,组装的AAV载体颗粒积聚在生产者细胞内,纯化方案通常描述一种从细胞裂解开始的过程,以将AAV颗粒与后续纯化步骤释放。AAV载体也可以在生产阶段从生产者细胞自发地释放到上清液中。然而,这并未充分表征,因为它不是一个常见事件。

什么是外容的AAV?

2012年,来自马萨诸塞州综合医院和哈佛医学院的凯西马奎尔和同事仔细研究了生产过程中从细胞释放的AAV载体(Maguire等,2012年)。他们看到这些AAV粒子的形状略有不同。这些AAV颗粒通常用细胞外肌肉,小膜囊泡或微泡(直径为40-150nm直径),其从细胞膜分泌到培养基中。AAV颗粒与外出组的外表面有关,或者在囊泡内部携带,其还可以含有其他细胞分子,例如蛋白质或核酸。载体和外部的这种结合称为vexosomes(载体 - 外肌肉),外侧Aavs或外部aavs(图1)。

研究人员发现,这些颗粒在常规纯化的AAV载体上具有一些优点。他们发现它们具有更高的转导效率,即相同数量的AAV颗粒能够感染更多细胞(如在不同细胞环境中所示,例如视网膜或胶质母细胞母细胞母细胞)。他们还发现,exo-aavs更耐用中和抗AAV抗体。这对于治疗应用特别有用体内其中内源性抗AAV抗体经常中和AAV载体的治疗效果。外来AAV图

外出Aavs如何产生?

净化exo-aavs实际上比古典更简单涉及Iodixanol梯度的纯化方案。用于隔离脱氧剂的电流纯化方案依赖于差动离心步骤,以将含有产物细胞的细胞培养上清液分离,然后富集含有AAV的微泡(图2)。

自Maguire及其同事的exo-aav隔离议定书的发展以来,其他研究人员试图修改它以提高产量。例如,将生产者细胞系与CD9的表达载体转染(用于微泡的已知标记分子),可以进一步改善AAV产率,因为CD9被认为增强外来运动的产生或稳定其结构或与AAV的相互作用(Schiller等人。,2018)。

从生产者细胞分泌的外泌体囊泡还含有可能改善转导性能的细胞大分子(例如蛋白质,核酸)。György和同事发现AAV颗粒与膜囊泡的关联保护它们免受抗体识别和灭活(György等,2014),但科学家尚未破译这些改进背后的机制方面。

外来AAV净化协议

到目前为止exosome aavs达到了什么?

EXO-AAV在不同的AAV血清型中改进了转换配置文件体外体内与常规AAV相比(AAV制剂总是向其基因组滴度标准化时)。实例包括使用EXO-AAV1用于在人耳聋的小鼠模型中转换内耳中的感觉细胞(György等,2017),在玻璃体玻璃体注射后的小鼠视网膜中的EXO-AAV2,以转换双极细胞和光感受器(Wassmer等Al。,2017)和表达血友病模型中肝脏的人凝血因子IX的EXO-AAV8(Meliani等,2017)。Exo-AAV9 was successfully shown to transduce neurons in the brain after systemic (i.v.) delivery in mouse (Hudry et al., 2016), and could also more effectively target less accessible cells, such as brain tumor stromal cells in a mouse model of glioblastoma (Volak et al. 2018).

外腔Aavs的结构与使用微绒粒作为用于药物递送的载体的使用有关,所述药物递送最近获得了感兴趣的特殊上下文,例如将治疗性蛋白质递送到大脑,这需要穿过血脑屏障的大脑。

总之,exo-aavs似乎以常规产生的aav颗粒具有类似的细胞类型。但是,EXO-AAV可能开辟改善基因交付的新方法。它们提高转导的效率,扩大靶细胞中的AAV和难以到达的区域,并且更耐抗AAV抗体灭活。

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参考

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György,Bence,等。“使用外虫关联的AAV通过基因递送到内耳细胞的听力拯救。”分子治疗25.2(2017):379-391。PubMed.PMID:28082074pmed中央PMCID:PMC5368844

Maguire,Casey A.等人。“微肠池相关的AAV载体作为新型基因递送系统。”分子治疗20.5(2012):960-971。PubMed.PMID:22314290。pmed中央PMCID:PMC3345986.

Meliani,Amine等。“增强肝脏基因转移和避免前哨封闭的AAV载体预先存在的体液免疫。”血液进步1.23(2017):2019-2031。PubMed.PMID:29296848。pmed中央PMCID:PMC5728288

Schiller,Lara Timantra,等。“通过过度表达来增强外渗的AAV的产生Tetraspanin CD9。”分子治疗方法和临床发展9(2018):278-287。PubMed.PMID:29707602。pmed中央PMCID:PMC5918177

Volak,Adrienn等人。“病毒载体介导的静脉内递送后脑肿瘤基质细胞的遗传修饰。”神经肿瘤学杂志139.2(2018):293-305。PubMed.PMID:29767307

Wassmer,Sarah J.,等。“鼻孔相关的AAV2载体在玻璃体内注射时介导鲁棒基因递送到小鼠视网膜中。”科学报告7(2017):45329。PUBMEDPMID:28361998。pmed中央PMCID:PMC5374486

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