Lambda Red:基于同源重组的基因工程技术

由贝丝学会主席

Beth Kenkel.

限制性内切酶克隆是什么分子克隆;然而,其最大限制之一是序列修改只能在限制酶切割位点进行。Lambda红色系统是一种可用于克隆或基因组工程的替代方法,并基于同源重组。它允许直接修改DNA大肠杆菌并且独立于限制位点。lambda red系统来源于lambda red噬菌体,它作为基因工程工具的使用通常被称为重组-同源的缩写recombi国家介导的遗传工程。它可以用来进行修饰的分类:插入和删除可选择和不可选择的序列,点突变或其他小的碱基对变化,以及蛋白质标签的添加。它还具有修改的灵活性大肠杆菌染色体,质粒DNA或BAC DNA。

要使用Lambda红重组系统来修饰您的靶DNA,首先将线性供体DNA底物(DSDNA或SSDNA - 见下文)电容为大肠杆菌表达红酶。然后这些酶催化底物与目标DNA序列的同源重组。这意味着克隆发生了在活的有机体内,而限制性内切酶克隆则是在试管中进行基因改变。供体DNA底物只需与目标位点同源的~50个核苷酸即可进行重组。

λ红重组系统的关键组成部分

Lambda红色组件lambda红色重组系统有三个组成部分(图1):1)Exo, 2) Beta和3)Gam。这三者都是与dsDNA底物重组所必需的;然而,当用ssDNA底物产生修饰时,只需要Beta。

Gam: Gam可以阻止内源性RecBCD和SbcCD核酸酶消化引入的线性DNA大肠杆菌

挂式:EXO是5'→3'DSDNA依赖性外来的外切酶。EXO将从5'端开始降解线性DSDNA,并产生2个可能的产品:1)如果DSDNA足够短,则单链3'悬垂或2)的部分DSDNA双链体,其整个互补链降解的SSDNA。

bet: Beta保护由Exo创造的ssDNA,并促进其退火到细胞内互补的ssDNA目标。与ssDNA寡聚物进行重组只需要β表达。

实验大纲

Lambda红重组过程的概述下面是一个普通的lambda red重组实验的概要(图2)。在接下来的章节中,将更详细地解释与传统限制性内切酶克隆不同的关键步骤。

  1. 衬底DNA设计和一代
  2. Lambda红重组基因的表达。
  3. 底物DNA的电穿孔和细菌的产卵。
  4. 重组克隆的选择和确认。

衬底DNA设计和一代

使用线性的dsDNA还是ssDNA底物取决于实验的目的。dsDNA底物最适合于大于20个核苷酸的插入或缺失,而ssDNA底物最适合于点突变或仅少量碱基对的改变。

DSDNA底物

可以使用PCR使用引物进行PCR制备,所述引物扩增感兴趣的DNA序列,并用50个碱基对同源性与靶向插入部位(图2,顶部)进行侧面。这些引物通常是〜70个核苷酸长(20个核苷酸,其向DNA感兴趣的DNA序列和50个与靶位点的区域的核苷酸)。DSDNA插入件的最佳应用包括:大的插入或缺失,包括可选择的DNA片段,例如抗生素抗性基因,以及不可选择的DNA片段,如基因替换和标签重组剂的典型频率为10个阳性克隆4.到10.5.殖民地。

感叹号.jpg.专家提示:使用具有校对能力的高保真Taq聚合酶生成dsDNA重组底物,以避免PCR过程中引入的错误。

ssDNA衬底

可以通过排序合成寡核苷酸或使短PCCR产物进行SSDNA底物。无论哪种方式,衬底应为〜70-100个核苷酸,具有位于序列中心的所需改变。由于λ红色具有更高的重组频率,当滞后的DNA靶向时,最好通过您的兴趣区域确定复制方向,并设计与滞后链互补的寡核苷酸。在实践中,更容易确定复制方向,而是设计瞄准两个股线的寡核苷酸。两个寡头寡领部分之一将重新组合比另一个更高的效率,并且您将在经验上发现,这是滞后的股线。

与dsDNA相比,ssDNA底物的效率更高,重组频率在0.1% - 1%之间,通过设计避免激活甲基导向错配修复(MMR)系统的寡核苷酸,可以将其提高到25-50%。MMR的工作是纠正DNA复制过程中发生的DNA不匹配。有两种方法避免激活MMR: 1)使用一种细菌,其关键的MMR蛋白被敲除或2)特殊设计的ssDNA寡核苷酸来避免MMR:

1)大肠杆菌与灭活MMR:使用大肠杆菌非活性MMR肯定是两种选择中更容易的,但这些细胞容易发生突变,它们的基因组会有更多意想不到的变化。

2)设计避免MMR激活的SSDNA oligos:设计避免MMR激活的寡核苷酸的两种方法。第一种方法是在编辑站点的6个基对中引入一个C / C不匹配。这是一个简单的修复,但只能在有限的情况下使用。An alternative approach is to flank the desired change with 4-5 silent changes in the wobble codons, i.e. make changes to the third base pair of the adjacent 4-5 codons that alter the nucleotide sequence but not the amino acid sequence of the translated protein. These changes can be 5’ or 3’ of the desired change.

表1:ds-和ss-DNA在重组中的应用概述

底物 最适合的应用程序 重组频率 特殊注意事项
dsDNA 插入或删除>20个核苷酸 10分中有1个4.到10.5. 使用高保真Taq聚合酶生成插入物
SSDNA 点突变或改变几个核苷酸 若避免MMR活化,则为0.1-1%或25-50% 介绍摆动密码子的C / C不匹配或静音变化,以避免MMR激活

Lambda Red重组基因的表达

有四种方法可以从具有综合缺陷的细菌2)从含有含有含有缺陷的细菌的细菌,3)来自Mini-λ或4)来自λ红噬菌体本身(这些中的每一个都将讨论下面有更多详细信息)。控制红色蛋白的表达对于最小化GAM表达的毒性作用和限制在组成型表达时发生的自发突变。您使用的重组系统取决于您要编辑的类型的DNA;然而,可以用以下任何描述的方法改性Bac DNA。

综合缺陷出版物的细菌菌株

一些人大肠杆菌存在由于缺陷的λ红噬菌体的整合而稳定表达λ红重组基因。一种这种菌株是DY380,其来自DH10B大肠杆菌拉紧。常用于重组的其他几种细菌菌株可以在T.homason伊兰语(一些在Addgene中也可以发现菌株,但请务必阅读相关的论文,以了解它们的特殊用途- *注意*不是所有链接菌株都包含Lambda Red系统)。

在一些菌株中,表达exo.βgam由内源性噬菌体启动子PL和阻遏物CI紧密调节。用于重组目的,抑制基因的温度敏感版本,CI857., 用来。该突变抑制器可防止在低温(30-34℃)下表达重组基因。将细菌转化为42℃15分钟,迅速灭活阻遏物并允许表达重组基因。在此之后,降低温度允许压缩机重新自然,再次压制表达exo.βgam。使用这种λ红色表达方法的主要优点是它不需要抗生素选择来维持重组系统的表达。该设置也可用于修饰染色体基因。在初始编辑事件之后,可以从主机的染色体中移除有缺陷的预兆大肠杆菌通过第二个λ红色重组事件。或者,如果修改的等位基因是可选择的,它可以通过P1转导转移到不同的遗传背景。

质粒

表达来自a质粒允许移动重组系统,但成功的实验需要表达的紧张调节。启动子常用于控制红色的表达包括IPTG-indible LAC启动子,阿拉伯糖诱导的PBAD启动子和内源性噬菌体PL启动子。选择质粒表达与这些启动子相关的阻遏物(LACI,ARAC,CI857.)来限制Red系统的泄漏表达式。用质粒表达lambda重组系统最适合编辑细菌染色体DNA,因为一旦产生重组克隆,就很容易去除重组系统。一个简单的方法是用一个具有热敏性的复制源的质粒来表达lambda红色基因。一旦不再需要这种重组系统,细菌就可以通过在42℃下生长来“治愈”。

mini-λ.

一种介于使用质粒和稳定整合缺陷噬菌体之间的混合方法是使用mini-λ,这是一种缺陷的、不复制的、圆形的噬菌体DNA片段,当它被引入细菌时,就整合到基因组中。Mini-λ利用内源的红色启动子pL和CI857.调节表达的抑制因子。抗生素可用于选择阳性克隆,但由于mini-λ稳定集成,药物选择不需要维持。当温度变化到42˚C时,不仅可以激活重组所需的红色基因,而且还可以导致表达intXIS.负责从宿主染色体切除迷你-λ的基因。此后,可以像质粒一样容易地从细菌纯化mini-λ。

噬菌体

表达红色系统的最终选择是使用Lambda红噬菌体,λ十四行,携带四环素抵抗基因和λ红色阻遏物CI857.。一旦介绍,前景稳定,不再需要药物选择。这种方法的一个缺点是它需要产生噬菌体,这不是常见的分子生物学技术。然而,这种方法的优点是您可以将红色系统稳定地集成到您自己的感兴趣应变中,如果需要,可以使用P1转换将修改移动到不同的背景中。这种方法最适合改性质粒或BAC,因为它导致噬菌体稳定地整合到大肠杆菌基因组。

重组克隆的选择与确认

如果插入了抗生素耐药性基因,首先可以通过抗生素耐药性选择重组体,但应进一步测试所有克隆,以确定是否存在所需的修饰。殖民地PCR.可用于在大多数情况下筛选阳性克隆,并且限制酶消化可用于筛选适当突变的质粒。应确认点突变和其他微妙的变化测序,这也是所有克隆的最佳最终确认,无论是针对修改的哪种类型的DNA:大肠杆菌染色体,质粒或BAC。

感叹号.jpg.专业技巧:SSDNA底物比DSDNA底物具有更高的重组率,因此您应该在使用DSDNA时筛选更多的克隆。

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非常感谢我们的客座博主,贝丝·肯克尔

Beth Kenkel.贝丝·肯克尔(Beth Kenkel)目前是华盛顿大学实验室医学系的一名研究科学家。她对科学传播和体外诊断特别感兴趣。

参考文献

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2.大翁宇,希拉里M. Ellis,E-Chiang Lee,Nancy A. Jenkins,Neal G. Copeland和Donald L. Court。大肠杆菌染色体工程有效的重组系统。PNA 2000 97(11)5978-5983;2000年5月16日,DOI:10.1073 / PNAS.100127597。PubMed.PMID:10811905..Pubmed Central.PMCID: PMC18544

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6.国家癌症研究所Recombineering页面

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