光片荧光显微镜

由Guest Blogger.

这篇文章由JAE LEE.Pantelis Tsoulfas.迈阿密大学神经外科的主任。

本世纪初,光学显微镜取得了一些重大进展,特别是在神经科学方面。显微镜的这些发展加上使组织透明的技术使显微镜能够以前所未有的细节以3D方式可视化整个组织的细胞结构。显微镜的这些进展之一是光片荧光显微镜(LSFM)。1902年,Richard Zsigmondy和Henry Siedentopf发明了这种基本方法,以提高研究胶体金的微观分辨率(1)。这种方法是基于使用阳光产生的光的薄片来观察直径小于4nm的单个金颗粒。

脊髓的侧视图,髓质和脊髓的第一部分,显示皮质脊柱,CST,脊髓和颅神经传统,用AAV8在人遍在蛋白C启动子下标记为EGFP。  脊髓的侧视图,髓质和脊髓的第一部分,显示皮质脊柱,CST,脊髓和颅神经传统,用AAV8在人遍在蛋白C启动子下标记为EGFP。解剖学缩写:GR =闪烁的道路,Cu = Cu =豆荚=背裂=背骨皮质脊髓脊椎,VCST =腹侧皮质脊柱脊柱,DC = CST,PD =金字塔,PT =金字塔= PON和MEDULLA,BP=基础PONS,孤零零的孤独的NST核。箭头指向样品的方向,a =前,p =后,d =背部,v =腹侧

光片荧光显微镜的发展

现代光片荧光显微镜最早由Voie及其同事首创,最初命名为正交平面荧光光学切片(OPFOS)(2)。David Burns和Francis Spelman将激光束聚焦到一个薄薄的薄片上,以照亮荧光样品,并使用垂直于照明平面的不同物镜(即光片)捕捉反射光。这与激光共聚焦显微镜相反,激光和反射光通过相同的物镜。使用这种方法,这些作者能够在3D重建一个清除的豚鼠耳蜗。在这次重建中使用的仪器的基本配置为所有后续版本的LSFM显微镜奠定了基础(3,4)。

在该初始应用之后,Stelzer的组描述了单面或选择性平面照明显微镜(Spim)。为了提高轴向分辨率并降低成像活标本的光毒性,它们将光纸显微镜组合与顺序多视图重建(5)。为了图像图像诸如清除啮齿动物大脑的大组织,超显微镜使用立体显微镜来捕获大视场(6)。关于其他几种LSFM配置的各种特性,请参见(4,7)。

光片荧光显微镜与共聚焦显微镜

共焦显微镜,样本的光学切片基于通过使用针孔来区分焦点反射光。然而,激发光激发了所有的荧光团当它通过标本时,通常会导致光漂白。此外,沿整个样本的点扫描使成像太慢,对于厚度毫米的大标本(8,9)。此外,由于光散射和吸收引起的深度增加,图像亮度下降。最后,用于检测共聚焦显微镜中的光的光电倍增器比LSFM中使用的现代摄像机效率低。


在LSFM中,激光片,通常为2-6微米,仅围绕检测镜头的焦平面的样品的一个薄平面照亮,因此没有焦点光。因此,比传统的激光扫描显微镜在常规激光扫描显微镜中有多少的光漂白或光损伤。由于使用具有电子乘以耦合的耦合器设备(EMCCD)或互补金属 - 氧化物半导体(CMOS)传感器的摄像机进行图像获取,因此需要几毫秒才能获得一个图像,从而显着减少通过A图像所需的时间大Z堆(8)。使用单侧照明的LSFMS的一个限制,特别是用大组织,是任何障碍物(例如气泡或高浓度的荧光团)沿着照明路径铸造阴影。所获取的图像(5)中的阴影显示为条带。解决这个问题的方法是从两个相对侧面照射和获取样本的图像,并合并图像,例如超显微镜。另外,调节激光片的厚度并使用多视图成像可以提供增强的分辨率(8,9)。因此,LSFM非常适合于对透明生物的透明样品的三维重建和体内成像。

组织清除的研究进展

类似于光学显微镜,本世纪中的组织清除技术存在显着进展。第一次成功尝试通过Walter Spalteholtz(10)完成了透明的固定解剖学制剂。他使用了苄醇和水杨酸甲酯的溶液,后来被其他人改性,以产生Murray的透明溶液。默里清楚的(11)大多用于研究脊椎动物胚胎的发展。通过使用光学投影断层扫描(OPT)(12)和后来的Hans-Ulrich Dodt的实验室获得了透明胚胎的第一三维重建在清除的全部安装样本上使用光纸显微镜,例如整体鼠标脑表达绿色荧光蛋白(6)。


Dodt和Frank Bradke实验室后来开发了3DISCO(溶剂清除器官的三维成像)方法,通过结合超微显微镜和四氢呋喃组织清除来成像啮齿动物的大脑和脊髓(13,14)。几年后,Karl Deisseroth的实验室开发了CLARITY,这是一种基于水凝胶的方法,也允许抗体穿透整个组织进行免疫组化标记(15)。CLARITY也与LSFM兼容,这种方法被称为COLM (CLARITY -optimized light-sheet microscopy)(16)。3DISCO和CLARITY都依赖于转基因小鼠,在转基因小鼠中,神经元亚群被GFP明亮地标记(例如Thy1-YFP-H小鼠)。然而,我们最近开发AAV(腺相关病毒)基于荧光标记方法,可与3Disco一起使用,以图像非转基因动物,例如大鼠(17)。此外,与转基因动物(17)相比,使用病毒的使用允许对标记方法进行更好的时尚控制。这些病毒质粒可通过addgene。LSFM具有多种组织清除策略和神经元标记方法的组合将极大地帮助我们在正常和患病条件下对中枢神经系统的结构功能关系的理解。


感谢我们的客座博主Jae Lee和Pantelis Tsoulfas。

JAE K. Lee.JAE K. Lee是迈阿密米勒医学院大学的助理教授。从Lee Lab寻找质粒在这里

Pantelis Tsoulfas.Pantelis Tsoulfas是迈阿密米勒医学院大学的副教授。从Tsoulfas实验室寻找质粒在这里

参考:

  1. H. Siedentopf和R,。Zsigmondy。(1902)安。物理。315,1 - 39。

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PubMed.
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  4. J. Huisken和D.Y.R. Stainier。(2009)。发展,136年,1963 - 1975。PubMed.
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  6. H.-U.Dodt,U. Leischner,A.Schierloh,N.Jährling,C.P.Mauch,K. Deininger等。(2007)。自然方法,4,331-336。PubMed.
  7. p·凯勒,m·b·阿伦斯。神经元,85,462-483。PubMed.
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  12. J. Sharpe,U. Ahlgren,P. Perry,Hill B,Ross A,J.Hecksher-Sorensen,R. Baldock,D. Davidson。(2002年)科学,296,541-545。PubMed.
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  15. K. Chung,J. Wallace,S.Y。Kim,S. Kalyanasundaram,A.。安塔曼,T.J.戴维森等人。(2013)自然,497,332-337。PubMed.
  16. 叶琳琳,薛伯伦,戴斯瑟罗斯。(2014) Nat Protoc。, 1682 - 1697。PubMed.
  17. c . Soderblom D.-H。Lee, A. Dawood, M. Carballosa等,(2015)eNeuro, 2015年3月/ 4月,2(2)e0001-15.2015。PubMed.
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