用光学开心的激酶照明细胞信号传导

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

信号转导途径是一种类似的手机网络。蛋白质激酶将消息提供给其途径的下一个成员,但是在激酶定位的情况下,它们的信号强度以及它们的信号持续所有冲击传输消息的信号强度。要研究信令途径,科学家经常使用生长因子或血清来刺激感兴趣的途径,但是由于其他信令网络也可以是非专门激活的,并且像电话的游戏一样,通常信号必须由中间信使传播。激酶活性的光学控制可以提供比药理或遗传方法更大的时空分辨率,但只有几种这样的方法存在,它们仅适用于激酶的子集。

问题:

没有共同的方法来创建光学控制的激酶。

解决方案:

在周等,林实验室呈现了一种用于创建照片开关的激酶的通用设计,并使用MEK1作为模型激酶。在该系统中,光用于通过附加两个二聚化照片可爱的Dronpa(Dron =消失的Ninja术语和Pa =)来转动“开”和“关闭”MEK1活动。P.hoto一种CTIVATION)组成型活跃的MEK1的活动位点两侧的域。这个照片开放的MEK1被称为PSMEK1当暴露在500 nm紫光灯时,Dronpa二聚体通过阻止活动位点在“关”设置中相互作用并锁定MEK1。Dronpa在暴露于500nm光时也产生绿色荧光。在400纳米的青色光下,Dronpa Dimers解离,Dronpa变黑,Mek1活跃或“开启”。因此,Dronpa的颜色表示MEK1的当前状态(绿色时,熄灭时,亮起)。

Photoswitch psmek1.

图1:PhotosWoxable Mek1(PSMEK1)。

是否有可能创建其他照片屏蔽的激酶?

PSMEK1的一般设计还致力于创建其他三种照片开放的激酶:psmek2.psraf1., 和PSCDK5。Mek2是丝氨酸/苏氨酸激酶,具有与MEK1相似的3D结构,但RAF1和CDK5具有较小的相似性。对于这三个激酶,将照片开放的Dronpa域插入到与兆上的位置同源的位点。MEK1,MEK2,RAF1和CDK5的照片可爱的版本都表现得类似于其内源性同行。另外,与衍生自衍生自的四聚体Dronpa,二聚体DronPa易于易于聚集在细胞中。

什么是光学开心的激酶适合?

有许多用于光学性激酶的潜在应用。以下是在周等人中证明的一些例子。

1.测试激酶抑制剂

周等综合检查激酶抑制剂通过使用改变RAF1-MEK-ERK路径信号的能力PSMEK1和一个E.RK激酶易位记者用MRUBY2荧光报告者(ERK KTR-MRUBY2)。

ERK信号传导

ERK KTR是MEK1磷酸化的目标,就像内源ERK一样,其本地化用作MEK1活动的指标。当MEK1活跃时,它将ERK KTR和红色荧光定位磷酸化,均为细胞质。当MEK1和ERK处于非活动状态时,ERK KTR不是磷酸化,并且可以在细胞核中发现红色荧光。对于测试激酶抑制剂,将表达细胞的PSMEK1和ERK KTR-MRUBY2与选择抑制剂一起温育,暴露于500nm的青色光以激活PSMEK1,并确定ERK KTR-MRUBY2的定位。如果抑制剂靶向MEK1或其下游靶ERK,则KTR仍然存在于细胞核中。但是,如果抑制剂靶向途径的上游成员(RAF1,EGRF),则KTR局部地局限于细胞质。

ktr assay.此全光PSMEK1 + ERK KTR-MRUBY2系统与现有方法有几个优点。首先,它避免激活其他信令途径,当血清或生长因子用作刺激时经常发生。该系统还允许精确地调制信号通路的特定臂(即MEK1下游的一切),绕过通路的上游部分并聚焦在下游步骤上。也可以确定信号传导效果的立即影响,因为您可以精确控制激酶活性的时序。

2.研究信号传导途径的负反馈回路

负反馈回路是信号转导途径的常见特征,但通常难以破译,因为难以产生激酶活性的短脉冲。周等通过创建短脉冲研究了内源MEK1 / 2磷酸化的负反馈psraf1.活动。它们通过将PSRAF1暴露于500nm灯的短2分钟脉冲(打开PSRAF1),然后3秒为400nm光(关闭PSRAF1)。此后,通过Western印迹以5分钟的间隔跟踪MEK1 / 2的磷酸化状态。在RAF1后灭活后5分钟的MEK1 / 2峰的磷酸化,然后降低。用PP1 / PP2A抑制剂治疗细胞导致磷酸化MEK1 / 2水平的维持,表明PP1 / PP2A负责该MEK1 / 2负反馈。

Mek负面反馈

3.研究信号通路体内

Cefelys的Ref-Mek-Erk表达光学性激动的激酶体内不仅允许在整个生物体的上下文中精确控制信号通路,而且还允许精确地激活主体部分中的激酶。周再次使用RAF-MEK-ERK信号传导途径来展示光学性激动酶的效用体内C. Elegans.

研究人员通常使用直肠细菌感染来诱导尾部肿胀C.秀丽隐杆线,但在皮下注射和肠道细胞中激活Raf-Mek-Erk信号传导C. Elegans.导致相同的表型。激活RAF-MEK-ERK信号通路psraf1.或者PSMEK1在这些相同的细胞中,24-48小时暴露于蓝光也诱导尾部肿胀〜75%的蠕虫(见下文)。周等人也使用了一个照片CDK5.C. Elegans.。有关这些实验的详细信息,请参见图4B和C在Zhou等人。光学开心的激酶可能用于其他模型系统,但需要在蓝色和紫色光可以渗透的组织或生物中表达。

如何在我的实验中尝试使用照片开关的激酶?

您可以从周等人找到质粒这里。此外,可以使用PDDRONPA来控制其他激酶和蛋白质。周等人表明,可以通过将Pddronpa结构域插入感兴趣的蛋白质的循环来产生更多的光学开心蛋白。如果您计划尝试此操作,重要的是检查蛋白质和PDDRONPA的功能是否保留。


参考

1.周,Xin X.,Linlin Z.Fan,Pengpeng Li,Kang Shen和Michael Z. Lin。“单链光学激酶通过单链光学酶的”光学控制“。科学355,没有。6327(2017):836-42。PubMed.PMID:28232577从该参考文献修改了图2-4。

2.宫殿,塞尔基,雅各布J. Hughey,布莱斯T. Bajar,Silvia Carrasco和Markus W.隐蔽。“活单细胞中多激酶活性的”高灵敏度测量“。细胞157,不。7(2014):1724-734。PubMed.PMID:24949979.。pmed中央PMCID:PMC4097317.

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