用激酶易位记者(KTRS)测量单细胞水平的激酶活性

由Beth Kenkel.

Beth Kenkel.

激酶:它们调节许多蛋白质,用〜1/3人类蛋白质预计至少有一个位点被磷酸化。磷酸化对于调节信号转导尤其重要,在单细胞水平上测量激酶活性可以帮助绘制信号活性和细胞表型之间的联系。监测活单细胞激酶活性的一种方法是烦恼但是,FRET记者对设计并难以复用。秘密实验室提供一种替代工具,其具有它们的激酶易位报告者(KTR),其细胞定位用作激酶活性的代理测量。Ktrs的关键优势在于它们易于创建和简单复用。

FRET激酶记者的问题

  • 难以复用:褶皱记者由两个具有非常特异性的光谱性能的荧光蛋白质组成,其限制荧光团可以伟德2021足球欧洲杯买球平台复用在一起。
  • 挑战设计:FRET报告活动取决于供体和受体蛋白的距离和取向,这可能难以预测。
  • 较慢的去磷酸化利率:与KTRs相比,基于FRET的报告基因的去磷酸化速率更慢,这可能是由于FRET报告基因的磷酸化构象更不易被磷酸酶接触到。

激酶易位报告者(KTRs)

激酶易位报告基因(KTRs)是基因编码的荧光激酶报告基因。KTR由一个荧光标记的激酶底物组成,该底物进一步融合到二部分核定位信号(bNLS)和核输出信号(NES),两者都是可磷酸化的。磷酸化前,KTR定位于细胞核,但磷酸化后bNLS活性被抑制,NES活性增强,导致报告基因的细胞质易位。因此,KTR根据其磷酸化状态进出细胞核。胞质和核荧光的相对比率可以作为激酶活性的一个指标。

激酶易位报告器原理图

ktrs的优势

与用于测量激酶活动的烦恼报告者相比,KTR有两个主要优点。首先,它们易于复用。它们的设计允许灵活地交换荧光蛋白和多路复用,当光谱重叠有限的荧光蛋白一起使用时很简伟德2021足球欧洲杯买球平台单。其次,克尔斯易于设计。KTR功能的关键决定因素是先前已经表征的可磷酸化残基和BNL和NES序列的位置。请参阅Kudo等人的框1。有关BNL和NES序列的设计的更多详细信息。

ktrs的缺点

与FRET记者相比,KTRS也有一些缺点。首先,KTRS监测在细胞质和/或细胞核中发生的全局激酶活性,而基于FRET的记者可用于测量特定亚细胞室中的激酶活性。其次,因为核心核和细胞质之间的ktrs梭,核出口和进口率可以影响ktr易位。来自封面实验室的工作表明,这些利率对KTR的影响可忽略不计,但核易位率是在设计KTR实验时要考虑的另一个变量。第三,KTRS不适合监测核包膜故障期间发生的激酶活动(没有核,没有核定定位以监测)。

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参考文献

Kudo,T.,Jeknić,S.,Macklin,D.N.,Akhter,S.,Hughey,J.J.,Regot,S.,S.和Covert,M.W.(2018)。使用易位记者单细胞激酶活性的活细胞测量。自然协议,13 1,155-169。PMID:29266096.

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