小鼠建模,第2部分:小鼠育种和杂交

由Aliyah Weinstein

我们的小鼠建模博客系列的第1部分,我们涵盖了可用于将遗传修饰引入小鼠胚胎的技术。但是一旦你产生了成长的转基因小鼠的殖民地,你能做什么?在这篇文章中,我们将介绍为什么和如何交叉小鼠以创建双敲除线和CRE-LOX线,以及如何在您的实验中正确控制转基因小鼠。

据您所知,有许多类型的转基因小鼠:转基因小鼠,敲蛋白和敲除小鼠,以及条件敲蛋白或敲除小鼠。虽然这些技术各自用于将一个修饰引入小鼠基因组中,但它们不常用于引入多种突变。这是因为随着将更多的突变引入单个胚胎中,鼠标在每一个等位基因的预期基因型最终将降低的可能性降低。 点击下载Addgene的质粒101电子书

通过对小鼠进行杂交来产生想要的表型

相反,基因工程应该用来单独将每个突变单独引入不同的小鼠中,然后应越过这些菌株以产生双突变体后代。穿越小鼠允许生产后代的后代,该后代具有设计成父母的突变的组合。以下是如何交叉小鼠,使用一个简单的例子,目的是生成在其基因组中具有两个修饰基因的小鼠,并假设德文遗产模式:

1.基因型你的亲代小鼠

为了确保你的基因修改将在F1代中传递给所有的后代,你的繁殖计划应该从亲代老鼠开始,每一只都是纯合子的两个突变之一,你想在你的后代中结合。基因分型包括从每只老鼠身上取一小片组织(通常通过抽血、夹尾巴或夹脚趾),然后使用聚合酶链反应使用适当的引物检测您的靶向载体或感兴趣的基因。

2.培育你的父母小鼠以产生f1

一旦你完成了第一个十字架,恭喜你!你已经培育出了F1小鼠,它们是培育出你想要的基因突变组合小鼠的下一步。假设你的亲代小鼠对你感兴趣的基因都是纯合的,你的F1小鼠将是那些等位基因的携带者。

有些等位基因,如Cre,在半合子时起作用,这意味着只需要一条染色体包含转基因基因就可以看到效果。半合子小鼠可以包括在育种策略相同的那些用于育种杂合子小鼠。在这种情况下,你的亲本小鼠在适当的等位基因上应该是半合子的。当杂交的老鼠是纯合的不同突变,F1后代将要么是半合子或在一个位点(例如Cre)零和在另一个杂合子。

3.培育您的F1代

现在,你的目标是培育出所有你想要的基因都是纯合的老鼠。还记得高中生物课上的庞尼特方格吗?它们在这里会派上用场!交叉你的F1杂合子彼此将产生大约1 / 16的老鼠,在你的基因的纯合子等位基因的利益。大约每4只老鼠中就有1只的等位基因是纯合的。你可以从你的F1代杂交纯合子或杂合子老鼠来继续建立你的殖民地。你应该基因型你所有的F1小鼠,以及后代。Dihybrid Cross树方法

4.继续繁殖你的蜂群

你需要在所有你想要的等位基因上产生足够多的纯合子(或半合子)老鼠来进行你的实验。在整个过程中,你也应该保持你的亲本菌株。

在F1和后代世代中,在一个或两个等位基因或杂合子中是纯合的野生型的小鼠不是浪费。最佳实践是在实验中使用凋落物控制 - 使用殖民地中的小鼠,而不是从股票中心订购控制小鼠。这是更好的控制,因为实验和对照小鼠将在同一环境中升起,并将含有类似的表观遗传修饰。

特殊的繁殖情况下

无论你的老鼠群体是由具有单一突变的基因工程老鼠还是杂交的菌株组成,有效繁殖你的老鼠都有许多需要考虑的因素。因为它们的生成涉及到一个新基因随机地整合到它们的基因组中,一些转基因菌株很难繁殖。影响繁殖的转基因小鼠的一些问题包括胚胎死亡率、寿命短或不育,这些问题可能由转基因的拷贝数、表达水平和整合位点引起。这些问题可以通过不同的方式来缓解。在工程转基因菌株之前,启动子应该在细胞系中测试,以确定它如何影响转基因的表达水平。在现有的小鼠品系中,转基因可以保持在半合子或杂合子背景下,以减少拷贝数或表达水平的影响。

当将小鼠与多个突变进行杂交时,另一个可能出现的挑战是,这些突变是否在同一条染色体上。同源染色体在减数分裂期间重组,产生配子,其中包含来自父母双方的遗传物质的混合。如果你试图杂交的两个突变都位于亲代的同源染色体上,它们也可能在未来的几代中留在单独的染色体上,被称为联动的概念。这会阻碍F2代和超越的小鼠的可能性对于两个突变将是纯合的。染色体上的两个感兴趣位置之间的距离越短,两个基因座之间的可能性不太过于横穿,这将使两个突变变为相同的染色体。直到在两个基因座,F2和后代发生在两种小鼠之间,直到每个突变等位基因只能是杂合的。减数分裂交叉重组

Cre-lox表达菌株

CRE-LOX菌株是源自交叉的小鼠的常见例子。在第1部分中,我们解释了表达两者的小鼠中的遗传重组CRE和LOXP.发生。但是这些老鼠一开始是怎么被造出来的呢?cre-lox小鼠是制作的通过用表达感兴趣的含氟基因的菌株表达CRE的菌株。CRE可以全局(在小鼠的每个细胞中)或以组织特异性方式表达(用组织特异性启动子控制的表达)。并且,CRE也可以是组成型表达的,或诱导(这在该系列的第1部分中的更多内容)。在任何情况下,CRE都是一种显性表型,而您希望碳基因是纯合的,以便克雷介导的重组以影响您的实验小鼠中的每种拷贝靶基因。这将需要几轮繁殖,您需要基因型你老鼠表达Cre loxP和你感兴趣的基因。为了确保您在实验中看到的效果是在浮动位点重组的结果,您的对照应该是表达Cre而不是loxP的幼猫。鼠标CRE LOX条件淘汰

使用此双级指南的鼠标造型现在完成,您应该准备好规划使用基因工程小鼠的实验策略。祝你的实验祝福!


参考

BECHER,Burkhard,Ari Waisman和Li-Fan Lu。“小鼠的条件基因靶向:问题和解决方案。”免疫力48.5(2018): 835 - 836。PubMedPMID:29768166.

Zickler,Denise和Nancy Kleckner。“减数分裂期间同源物的重组,配对和突触。”生物学中的冷泉港视角7.6 (2015): a016626。PubMedPMID:25986558。pmed中央PMCID:PMC4448610

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