小鼠建模,第1部分:基因工程小鼠

通过读经文温斯坦

老鼠是一个常见的生物模型用于了解哺乳动物的特征和基因工程小鼠模型为研究人员提供了有用的和适应性的工具,以执行基础和临床前研究。对于刚开始使用老鼠模型的科学家来说,这种可能性似乎是无穷无尽的——而且势不可挡。

在本系列的第一个博客文章中,我将突出术语您应该熟悉在使用鼠标模型之前,几种用于在胚胎阶段创建工程鼠标模型的几种常见技术,以及不同基因组编辑技术的优缺点。

近交系和远交系

研究中使用的小鼠菌株可以下降两种广泛分类:自交或差异。近交菌株共享常见的遗传背景,这意味着每只小鼠是遗传相同的,并且所有小鼠的所有小鼠在几乎所有基因座都是纯合的。这降低了基因型和表型的可变性,有助于提高实验的再现性。近晶小鼠特别适用于理解与实验性操纵有关的特定效果。常见的近交菌株包括C57BL / 6,BALB / C和129。

相反,脱击菌株最初来自非特征化背景小鼠之间的随机交叉,以创建有限但遗传的基因库。脱盐菌株是战略性的,以维持人群中最大的遗传杂合子,这意味着它们更加密切地模仿人口的遗传多样性。郊游的小鼠株可用于比较显性和隐性性状及其对疾病或治疗的影响,但对基因工程无用。郊游菌株的例子包括瑞士韦伯斯特和Harlan(HSD)国家卫生研究院(NIH)瑞士。

基因工程小鼠

通过将含有感兴趣基因的靶向载体或胚胎干细胞插入胚胎中的胚胎干细胞中可以通过将靶向载体进行设计。有几种类型的转基因小鼠:转基因小鼠,敲除小鼠和小鼠,条件或诱导基因表达。

转基因和Knockin小鼠

顾名思义,转基因小鼠和敲入小鼠的基因组中含有一种额外的基因。转基因小鼠将新的基因结构随机地植入到基因组中,而敲入小鼠则将基因结构插入到特定的位置。

为了培育转基因老鼠,DNA或感染与病毒载体的显微注射含有基因构建体可用于将目的的基因插入到基因特或胚胎干细胞中。非同源重组将该DNA随机掺入小鼠基因组中。相反,通过同源重组产生基因菌株。将靶向载体电穿孔到胚胎干细胞中,这将使用侧翼的同源性臂在基因组内的特定位点插入基因。在任何一种情况下,也包括阳性选择标记,例如抗生素抗性基因,以选择成功改性的Zygotes或胚胎干细胞。将改性的胚胎干细胞注射到胚泡中,然后将其注入到母动物中以进行妊娠。

ESC胚胎的显微注射诱导双链DNA断裂的核酸酶,例如ZFN.talen.,可以用来制造敲打老鼠。将含有同源末端的靶向载体共注射到断点促进了靶向载体的同源重组。CRISPR / Cas9基于基因的系统已经被开发出来用来产生敲打老鼠,但是因为CRISPR / Cas9工程新插入的基因可能在DNA修复过程中被错误引入到核苷酸序列中,有利于通过非同源端连接进行DNA修复。促进同源重组的小分子的加入长单链DNA的使用导致了对精确基因插入的同源重组效率更高。然而,CRISPR / CAS9系统对产生敲除小鼠更有用。

敲门小鼠

昏死小鼠经历了遗传修饰,其改变或消除特定基因的表达。用于产生敲除小鼠的靶向载体包括成分基因,其取代靶向基因,并提供了一种追踪成功工程细胞的方法。类似于转基因小鼠,使用几种技术之一在胚胎干细胞阶段期间设计敲除小鼠。最长的站立技术是将靶向载体注射到胚胎干细胞中,然后将其注射到胚泡中。

核酸酶也可用于工程师敲除小鼠。ZFN,TALEN和CRISPR / CAS9系统都能靶向到基因组的特定区域,并在DNA损伤部位诱导非同源修复。将这些核酸酶微注射到受精卵中,然后将受精卵植入雌性小鼠体内进行妊娠。这三种基因都可以引入多碱基对缺失,但CRISPR/Cas9也可以引入点突变。

虽然使用靶向核酸酶生成工程小鼠模型比单独注射靶向载体有优势,但仍存在一些挑战。核酸酶可能会对基因组中与目标位点相似的区域产生脱靶效应,或者产生嵌合动物,在这些嵌合动物中,通过注射胚胎干细胞并不是所有的囊胚细胞都被成功编辑。此外,由于非同源修复是一个随机过程,使用相同核酸酶编辑的受精卵可能不会导致基因相同的小鼠。因此,科学家必须对每一种动物进行基因型化,以识别出具有所需基因型的动物。

诱导和条件系统

条件knockouts或knockins

转基因小鼠的一部分,条件敲除/敲蛋白小鼠,使用Cre-lox复合系统在特定的细胞或特定的刺激下表达转基因。Cre重组酶催化位于两个loxP位点之间的DNA序列的重组。loxP位点存在于靶向载体中基因的两端,形成了floxed基因片段。将含有floxed基因的小鼠与表达Cre的菌株(将在本系列博客的第2部分详细讨论)杂交,可以根据Cre表达的细胞控制条件重组发生的细胞类型。

CRE和LOXP表达小鼠分别设计,然后越过CRE-LOX小鼠

该技术的几种变化可用于定制该重组的效果。为了产生条件敲除小鼠,LOXP位点直接插入基因组中以侧翼在CRE介导的重组后缺失的基因。在有条件的基本小鼠中,靶基因最初通过在靶向载体中的靶基因上游的止动盒存在抑制。止动盒浮动,因此Cre-介导的重组删除止动盒,这允许靶基因的表达。另外,CRE-LOX系统可用于反转DNA的一段或将一块DNA与基因组的一个区域翻译成另一个区域。

诱导基因表达

另一种类型的转基因小鼠模型允许通过调节CRE表达的药物或小分子来控制基因表达。用于诱导CRE表达的最常见的药物是Tamoxifen。在Tamoxifen-Invucible Cre(CRE-ER)系统中,CRE融合到雌激素受体α的配体结合结构域(ESR1)。将小鼠喂食或注射三种毒物,其缓解了阻断CRE表达的ESR1结构域的自然抑制。然后,表达CRE和CRE介导的细胞中碳氟锭的重组。类似的系统包括四环素或多西环素介导的Cre激活,通过TetON或TetOFF系统诱导或抑制Cre表达。

所以现在有希望创造一只基因工程老鼠似乎没有那么势单力敌!在本系列的第二篇博文中,我将讨论交叉和维持一个小鼠品系。

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