多色动物:利用荧光蛋白了解单细胞行为伟德2021足球欧洲杯买球平台

由Aliyah Weinstein.

“彩虹”转基因表达可以用多种颜色标记细胞随机多色标记是神经科学和发育生物学中的流行技术。这种类型的细胞标记技术涉及引入含有不同颜色的荧光蛋白(XFP)的转基因构建体以标记器官或整个生物。伟德2021足球欧洲杯买球平台因为每个细胞可以具有将独立重组的转基因的多个转基因副本,所以当表达XFP的组合时,细胞可以获取各种颜色之一。每个细胞仍然与其整个寿命和子细胞保持相同的颜色保持相同的颜色,允许随着时间的推移允许细胞群的命运映射。通过在开发过程中允许细胞变得坚持不懈的荧光的工具,可以实现在有机体水平处跟踪有机体水平的单个细胞动态的能力。随机多色标签系统,基于颅骨,现在存在各种物种,细胞类型和研究应用。

标记神经元与档案

李奇曼小组开发了这项技术的最初版本是在2007年。该团队将这项技术用于标记小鼠小脑中的神经元,并恰当地为其命名脑袋大脑彩虹1.0使用荧光素RFP(红色),YFP(黄色)和膜系CFP(青色)。Brainbow 1.1添加了OFP(橙色)(Livet等,2007)。

猜测使用A.Cre /液态氧系统标记神经元。编码荧光蛋白的基因与单个启动子串联组织伟德2021足球欧洲杯买球平台,但只有直接跟随启动子的基因被表达。cre介导的这些基因中一个或几个的缺失允许在构建中较下游的基因表达。在Brainbow 1.0和1.1中,RFP和OFP分别位于启动子的直接下游,细胞会发出红色或橙色的荧光,直到重组发生。

Brainbow 1.0和1.1采用cre重组

随着Brainbow 1.0的开发,又开发了几个更完善的版本,在系统中使用的荧光蛋白的数量、稳定性和亮度上都有所不同。伟德2021足球欧洲杯买球平台

一个这样的系统是颅弓2.0,它使用CRE触发两个基因的反转对齐的头部到头。另一个变异脑袋2.1使用CRE触发两组串联基因的反演,对齐头部对头和缺失其中一种基因对。因此,Brainbow 2.0作为默认RFP和CFP之间的开关,而Brainbow 2.1从默认GFP(绿色)切换到RFP,CFP或YFP荧光。在Brainbow 2.1中,GFP用核定位序列标记,使其定位于比CFP和YFP的电池的不同区域。

brainbow 2.1包含两对XFP

Brainbow的最新衍生,大脑彩虹3.0(Cai et al., 2013),结合了高光稳定性的荧光团mOrange2、EGFP和mKate2(红色),解决了先前版本的“彩虹”荧光强度低的问题。由Brainbow 3.0开发,使用相同的荧光标记,Brainbow 3.1和3.2(在同一出版物中描述)是唯一的,因为默认情况下,它们不是荧光的。相反,他们将截断的、非荧光的YFP作为转基因的默认状态,因此需要重组来切除非荧光的YFP,激活下游OFP、GFP或RFP的荧光。通过对截断的YFP进行免疫染色,可以检测表达该结构但没有重组的细胞。

Thy1-Brainbow小鼠,一些神经元表达多达16个注射转基因的副本,每个拷贝可以重组以激活不同荧光蛋白的表达。因此,每个细胞可以表达来自注射构建体的所有荧光蛋白的独特组合。伟德2021足球欧洲杯买球平台在单个细胞中表达的荧光蛋白在细胞的整个长度上保持其颜色,甚至长达100微米的轴突。

Brainbow系统的一些挑战是,它没有使用无处不在的启动子,这意味着不是所有的细胞类型都可以被标记,而且虽然转基因的多个拷贝可以整合到细胞中,但这些XFP的表达水平还不够强,不足以用于所有的应用。为了解决这个问题,类似的系统已经开发出来,用于追踪各种细胞类型和生物体,并提高大脑随机多色标记的细节水平。

标签果蝇神经元有dBrainbow和Flybow

基于Brainbow 1.0系统,果蝇大脑彩虹(dbrainbow.;汉普尔等,2011)在神经细胞阶段标记果蝇神经元,这意味着同一谱系的神经元将在成人飞行中表达相同的XFP转基因。作为止动盒位于荧光蛋白基因的直接位于荧光蛋白基因的上游,在荧光发生之前需要CRE重组。CRE重组酶可以与使用FLP重组的飞行研究一起使用常见的现有工具。除了构建体中的XFP之外,DBrainbow还包括与每个XFP融合的小型表位。靶向这些表位并以与熔融XFP相同的颜色荧光荧光的二级抗体可用于扩增信号。活体动物中的内源性荧光仅允许可视化两种颜色。

同样的,flybow.适配Brainbow 2.0用于黑腹果蝇并受Flp重组酶控制。Flybow中的XFPs是膜系的,这使得该系统对细胞扩展的可视化非常有用,比如苍蝇视觉系统中的神经元,这在以前一直难以研究(Hadjieconomou et al., 2011)。dBrainbow和Flybow用于果蝇的多色标记

用Zebrabow追踪斑马鱼的细胞

在斑马的世代之前(Pan等人,2011),灌木丛也用于在胚胎阶段注射CMV脑袋结构。该技术可用于通过在神经特异性启动子的下游放置颅骨来靶向神经元,或者通过在单细胞阶段注射灌注脑来标记整个鱼。斑马马或“斑马鱼脑投”是一系列转基因斑马鱼系的集合,允许整个生物体或特定组织的多色标记。使用称为的质粒构建体引入XFPZebrabow-GateDest包含一个普遍存在的启动子下游的RFP、CFP和YFP。斑马鱼是一种非常通用的技术,通过Cre蛋白微注射或将斑马鱼动物杂交到可诱导的Cre系,可以诱导重组鱼的发育。的Schier集团开发了Zebrabow系统,利用了来自Brainbow的多色标签。

用五彩鼠追踪克隆细胞群

地穴和彩鼠绒毛对于哺乳动物系统,克利夫斯实验室开发了五彩纸屑鼠标(Snippert et al., 2010),当与表达适当细胞的小鼠杂交时,可以用来追踪任何细胞类型Cre等位基因。五彩鼠标中包含了Brainbow 2.1结构Rosa26基因座,在loxP“路障”下,使XFP只在重组事件后表达。在这种小鼠中,组织特异性Cre重组产生的细胞在特定细胞类型中随机表达核GFP、膜CFP、细胞质YFP或细胞质RFP。

“五彩鼠”首次被用来描述肠隐窝内细胞的自我更新,从那时起,它就成为了理解细胞增殖的有力工具。

uby鼠标中的诱导XFP表达式

另一个小鼠记者动物Ubow(Ghigo et al., 2013),是由Brainbow 1.0- l结构开发的,是包含RFP、CFP和YFP的Brainbow 1.0的变体。在进入他莫昔芬诱导的泛素背景后,每个表达Cre的小鼠细胞都经历了一次重组事件,导致每个表达YFP或CFP的转基因细胞复制,而不表达Cre的细胞用默认的RFP发出荧光。

Ubow结构随后被用于开发一种追踪朗格汉斯细胞命运的系统。在Ubow小鼠中,表达YFP、CFP和RFP的细胞并不以相同的频率出现。CFP++细胞的小种群大小使研究人员能够纵向绘制真皮层中朗格汉斯细胞的周转情况,并确定朗格汉斯细胞是通过特定的(而不是所有的)朗格汉斯细胞的增殖来补充的,从而形成增殖细胞的病灶。

Tetbow为当前技术进行归档

Tetbow(Sakaguchi等,2018)通过结合A克服颅骨XFP的低表达Tet-Off系统促进XFP表达。Tetbow增加的亮度使该系统可以在多个视场上追踪毫米长的神经元,而以前的Brainbow技术只能在一个视场内识别神经元。Tetbow可以介绍在活的有机体内无论是电穿孔质粒,还是使用AAV载体。

IMAI实验室他还开发了一个版本的Tetbow,采用化学标签代替XFP来优化组织清除,这是一种使组织(如大脑)透明的方法,从而使荧光神经元的3D结构可见。化学标记对组织清除方法更有抵抗力,可以用合成荧光团标记,这比荧光蛋白更稳定。伟德2021足球欧洲杯买球平台要了解更多细节,请查看这个博客来自开发Tetbow的研究人员。

结论

随机多色细胞标记系统允许在各种生物体的单细胞动力学被观察到比以往任何时候都更详细。随着科学家们继续开发这些技术的新迭代,预计将看到使用更新、更稳定的荧光团的系统,并可以与新的成像技术相结合。

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参考文献

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