注:Cpf1又称Cas12a。
CRISPR-Cpf1基因组编辑有了新进展!一个最近的一篇论文从冯张的实验室描述了如何使用Cpf1进行多重基因组编辑。由于一些原因，与Cas9相比，Cpf1是一个用于编辑多个目标的简化系统。继续阅读以了解更多关于Cpf1多路复用的信息。要深入了解Cpf1，请查看这博客文章或看Addgene的CRISPR指南页面审查Cas9。有关Cpf1和Cas9的简要比较，请参见下表。
表1。比较Cas9和Cpf1 CRISPR核酸酶
| Cas9 | Cpf1 | |
| 组件 | crRNA tracrRNA Cas9 |
crRNA |
核酸内切酶的大小 |
spCas9: ~ 4 kb |
~ 3.9 kb |
| crRNA / gRNA长度 | gRNA: ~ 100元 | crNA: ~ 42元 |
| 需要tracrRNA吗? | 是的 | 没有 |
| dsDNA乳沟 | 钝端 | 5 '过剩 |
| PAM序列 | NGG | TTTV |
| PAM网站保存吗? | 通常破坏 | 是的，Cpf1分裂了原太空飞船的5' |
在Cpf1 crRNA阵列之前复用CRISPR-Cas9选项
在这种新的Cpf1多路复用方法之前，其他多重CRISPR基因编辑方法完全依赖于Cas9。总的来说，这些方法有两个主要的缺点:
1)大多数依赖于转染多个载体来表达gRNAs和Cas9。由于拷贝数的差异，共转染可以导致可变的表达水平。而且通常的转染也有缺点:瞬时表达和需要转染细胞系。
2)它们需要更大的表达载体，而这些载体往往难以转染或包装成病毒载体。伟德BV下载Cas9多路复用载体更大，因为它们需要调控序列来表达多个gRNAs(即Csy4裂解序列、tRNAs、多个单个启动子)。spCas9及其grna也比Cpf1大。
表2。Cas9复用选项
| 多路复用的方法 | 交货方法 | 优势 | 缺点 | 参考文献 |
| 山本实验室金门组装 | 转染 |
其中一个载体表达Cas9和多达7个gRNAs |
每个gRNA都需要自己的启动子 |
|
多路慢病毒表达盒 |
慢病毒转导 |
其中一个载体表达Cas9、eGFP和多达4个gRNAs | 每个gRNA都需要自己的启动子 | Kabadi仍等 |
| Csy4-Cleavable磁带 | 转染 | 多顺反子转录物表达的gRNAs | 需要共转染Cas9 | 它和等 蔡等 |
| PTG磁带 | 转染 | 多顺反子转录物表达的gRNAs | 需要共转染Cas9 | 谢等 |
与Cpf1多路复用crRNA表达
与Cpf1多路复用crRNA表达的关键优势在于Cpf1可以处理自己的前crRNA阵列。Zetsche等通过显示Cpf1可以切割4个crrna阵列来证明这一点在体外在293细胞中表达。这允许一个单一启动子驱动crRNA阵列的表达，而不需要表达其他内切酶，如Csy4，或包含处理信号，如tRNAs，来将阵列加工成功能性crRNA。
Pro-Tip
Cpf1处理自己的前crrna阵列的能力将其年代crRNA克隆过程。Zetsche等人使用了4个由直接重复序列和crRNA组成的寡核苷酸进行克隆。类似于拼图游戏，寡聚物被设计为只有一个方向在一起退火的粘性末端。请参阅下面的图表以了解其工作原理。确保顺序5 '磷酸化寡核苷酸或用T4 PNK处理。
Cpf1多路传输选择:转染、慢病毒和AAV
Cpf1能够处理自己的前crRNA阵列，因此不需要包含多个启动子来驱动crRNA表达和允许阵列处理的序列，如tRNAs或Csy4切割位点。这消除了crRNA表达质粒的体积，从而产生更小、更流线化的载体，更容易在多个表达平台上使用:转染、慢病毒转导和AAV转导。在Zetsche等人的大多数实验中，使用了共同表达Cpf1和crRNA阵列的单一载体。在转染过程中，当4个crrna阵列、Cpf1和GFP标签被转染到一个质粒上时，6.4%的HEK293T细胞在4个靶点中的4个位点进行了编辑。与之相对的是，2.4%的细胞转染了每个质粒包含一个crRNA和一个Cpf1表达载体的质粒。单质粒转染与合用质粒转染编辑频率比较如图2所示;对于多次编辑，单个质粒通常更有效。
Pro-Tip
在慢病毒载体上表达Cpf1多重系统时，确保逆转crRNA直接重复的方向。慢病毒携带DNA序列的(+)链RNA拷贝，这是适合Cpf1的底物。这意味着Cpf1可以结合和切割慢病毒RNA，防止病毒的包装。逆转直接重复的方向可以保护(+)链慢病毒RNA免受cpf1介导的裂解。这种逆转也会阻止crRNA阵列在细胞中表达时的处理，但请注意Zetsche等人是如何逆转驱动crRNA阵列表达的启动子方向的(粗体红色箭头)。这就取消了直接重复的原始逆转，导致Cpf1可以处理crRNA阵列的表达。
最后,一个AAV载体用于小鼠神经元原代培养中3-4个基因的多重编辑在活的有机体内。在这些实验中，细胞被1:1比例的两种aav感染，一种表达Cpf1，另一种表达crRNA阵列加GFP标签。感染后4周，Cpf1和GFP在靶脑区有较强表达，约75%的神经元被Cpf1和GFP共转导。在这些神经元中，~15%的神经元在3个靶向位点上都有indels。请参阅下表以了解多路复用效率的摘要在活的有机体内。
利用CRISPR- cpf1进行多重基因编辑是CRISPR技术的最新发展之一。这是一个简单而有效的方法，适用于多个应用程序(在体外,在活的有机体内，转染，病毒转导)，同时多基因编辑与单一crRNA阵列。
你是我对使用Cpf1多路复用有兴趣吗?检查Cpf1复用质粒从Addgene可用。如果您对Cpf1多路复用有任何问题或想法，请在下面的评论中留言。
参考文献
1.Zetsche et al。“用CRISPR-Cpf1组合一个crRNA阵列来编辑多重基因。”自然生物技术35.1(2016): 31-34。PubmedPMID: 27918548。
2.Zetsche, B.， Gootenberg, J.， Abudayyeh, O.， Slaymaker, I.， Makarova, K.， Essletzbichler, P.， Zhang, F.(2015)。Cpf1是一类2类CRISPR-Cas系统的单rna引导内切酶。细胞,163(3), 759 - 771。PubMedPMID: 26422227。公共医学中心PMCID: 4638220。
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