使用CRISPR-Cpf1进行多重基因组编辑

由贝丝学会主席

注:Cpf1又称Cas12a。

CRISPR-Cpf1基因组编辑有了新进展!一个最近的一篇论文冯张的实验室描述了如何使用Cpf1进行多重基因组编辑。由于一些原因,与Cas9相比,Cpf1是一个用于编辑多个目标的简化系统。继续阅读以了解更多关于Cpf1多路复用的信息。要深入了解Cpf1,请查看博客文章或看Addgene的CRISPR指南页面审查Cas9。有关Cpf1和Cas9的简要比较,请参见下表。

表1。比较Cas9和Cpf1 CRISPR核酸酶

Cas9 Cpf1
组件 crRNA
tracrRNA
Cas9

crRNA
Cpf1

核酸内切酶的大小

spCas9: ~ 4 kb
saCas9: ~ 3 kb

~ 3.9 kb
crRNA / gRNA长度 gRNA: ~ 100元 crNA: ~ 42元
需要tracrRNA吗? 是的 没有
dsDNA乳沟 钝端 5 '过剩
PAM序列 NGG TTTV
PAM网站保存吗? 通常破坏 是的,Cpf1分裂了原太空飞船的5'

在Cpf1 crRNA阵列之前复用CRISPR-Cas9选项

在这种新的Cpf1多路复用方法之前,其他多重CRISPR基因编辑方法完全依赖于Cas9。总的来说,这些方法有两个主要的缺点:

1)大多数依赖于转染多个载体来表达gRNAs和Cas9。由于拷贝数的差异,共转染可以导致可变的表达水平。而且通常的转染也有缺点:瞬时表达和需要转染细胞系。

2)它们需要更大的表达载体,而这些载体往往难以转染或包装成病毒载体。伟德BV下载Cas9多路复用载体更大,因为它们需要调控序列来表达多个gRNAs(即Csy4裂解序列、tRNAs、多个单个启动子)。spCas9及其grna也比Cpf1大。

表2。Cas9复用选项

多路复用的方法 交货方法 优势 缺点 参考文献
山本实验室金门组装

转染

其中一个载体表达Cas9和多达7个gRNAs

每个gRNA都需要自己的启动子

佐久间等

多路慢病毒表达盒

慢病毒转导

其中一个载体表达Cas9、eGFP和多达4个gRNAs 每个gRNA都需要自己的启动子 Kabadi仍等
Csy4-Cleavable磁带 转染 多顺反子转录物表达的gRNAs 需要共转染Cas9 它和等
蔡等
PTG磁带 转染 多顺反子转录物表达的gRNAs 需要共转染Cas9 谢等

与Cpf1多路复用crRNA表达

与Cpf1多路复用crRNA表达的关键优势在于Cpf1可以处理自己的前crRNA阵列。Zetsche等通过显示Cpf1可以切割4个crrna阵列来证明这一点在体外在293细胞中表达。这允许一个单一启动子驱动crRNA阵列的表达,而不需要表达其他内切酶,如Csy4,或包含处理信号,如tRNAs,来将阵列加工成功能性crRNA。

Pro-Tip

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.pngCpf1处理自己的前crrna阵列的能力将其年代crRNA克隆过程。Zetsche等人使用了4个由直接重复序列和crRNA组成的寡核苷酸进行克隆。类似于拼图游戏,寡聚物被设计为只有一个方向在一起退火的粘性末端。请参阅下面的图表以了解其工作原理。确保顺序5 '磷酸化寡核苷酸或用T4 PNK处理。

crRNA寡核苷酸的单向退火

Cpf1多路传输选择:转染、慢病毒和AAV

Cpf1多路复用Cpf1能够处理自己的前crRNA阵列,因此不需要包含多个启动子来驱动crRNA表达和允许阵列处理的序列,如tRNAs或Csy4切割位点。这消除了crRNA表达质粒的体积,从而产生更小、更流线化的载体,更容易在多个表达平台上使用:转染、慢病毒转导和AAV转导。在Zetsche等人的大多数实验中,使用了共同表达Cpf1和crRNA阵列的单一载体。在转染过程中,当4个crrna阵列、Cpf1和GFP标签被转染到一个质粒上时,6.4%的HEK293T细胞在4个靶点中的4个位点进行了编辑。与之相对的是,2.4%的细胞转染了每个质粒包含一个crRNA和一个Cpf1表达载体的质粒。单质粒转染与合用质粒转染编辑频率比较如图2所示;对于多次编辑,单个质粒通常更有效。

Pro-Tip

exclamation.jpg__65x63_q85_subsampling-2_upscale.png在慢病毒载体上表达Cpf1多重系统时,确保逆转crRNA直接重复的方向。慢病毒携带DNA序列的(+)链RNA拷贝,这是适合Cpf1的底物。这意味着Cpf1可以结合和切割慢病毒RNA,防止病毒的包装。逆转直接重复的方向可以保护(+)链慢病毒RNA免受cpf1介导的裂解。这种逆转也会阻止crRNA阵列在细胞中表达时的处理,但请注意Zetsche等人是如何逆转驱动crRNA阵列表达的启动子方向的(粗体红色箭头)。这就取消了直接重复的原始逆转,导致Cpf1可以处理crRNA阵列的表达。

在病毒包装过程中,逆转crRNA的直接重复以保护Cpf1介导的分裂的慢病毒Cpf1结构示意图

最后,一个AAV载体用于小鼠神经元原代培养中3-4个基因的多重编辑在活的有机体内。在这些实验中,细胞被1:1比例的两种aav感染,一种表达Cpf1,另一种表达crRNA阵列加GFP标签。感染后4周,Cpf1和GFP在靶脑区有较强表达,约75%的神经元被Cpf1和GFP共转导。在这些神经元中,~15%的神经元在3个靶向位点上都有indels。请参阅下表以了解多路复用效率的摘要在活的有机体内

三种crrna阵列靶向AAV转导小鼠神经元的体内编辑效率饼图利用CRISPR- cpf1进行多重基因编辑是CRISPR技术的最新发展之一。这是一个简单而有效的方法,适用于多个应用程序(在体外,在活的有机体内,转染,病毒转导),同时多基因编辑与单一crRNA阵列。

你是我对使用Cpf1多路复用有兴趣吗?检查Cpf1复用质粒从Addgene可用。如果您对Cpf1多路复用有任何问题或想法,请在下面的评论中留言。


参考文献

1.Zetsche et al。“用CRISPR-Cpf1组合一个crRNA阵列来编辑多重基因。”自然生物技术35.1(2016): 31-34。PubmedPMID: 27918548。

2.Zetsche, B., Gootenberg, J., Abudayyeh, O., Slaymaker, I., Makarova, K., Essletzbichler, P., Zhang, F.(2015)。Cpf1是一类2类CRISPR-Cas系统的单rna引导内切酶。细胞,163(3), 759 - 771。PubMedPMID: 26422227。公共医学中心PMCID: 4638220

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