MXS链接

由莱拉哈利

Leila Haery.

简言之,高通量克隆就是将不同的基因序列系统地组合成质粒DNA。在高通量克隆技术中,尽管遗传元素的特定序列可能不同(例如,一组不同的哺乳动物启动子),但相同克隆的过程可用于将每个元素合并到最终构造中。该策略可用于构建具有多种功能的载体,应用于许多生物学领域。在合成生物学例如,高通量克隆可以用来组合不同基因元素的功能,产生非自然的工具,如新的生物电路或传感器。鉴于荧光蛋白的扩展调色板和强大成像技术的可用性,结合多个荧光蛋伟德2021足球欧洲杯买球平台白序列来开发不同的荧光报告子是高通量克隆的一个有用的应用。MXS链接是这样一种技术,并已用于生产复杂的荧光报告结构。这些荧光报告基因可用于检测结构和蛋白定位,以及基因表达和细胞迁移等细胞过程(Sladitschek和Neveu, 2015)。

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MXS链接的起源和目的

mxs - chains被设计用于在哺乳动物细胞中创建用于荧光成像或流式细胞术应用的质粒。该方法中使用的模块包括荧光蛋白、启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、诱导基因表达序列伟德2021足球欧洲杯买球平台等。通过组合这些成分,可以生成可视化细胞周期动态、滴定诱导转基因表达或其他各种聪明应用的结构。

图1来自MXS构建在HeLa细胞中的荧光蛋白表达

在一个实例中,使用MXS-Chaining产生的模块化构建体用于标记活细胞中的亚细胞结构。产生四种个体表达构建体,每个表达构建体均含有独特的荧光蛋白,它们之间具有最小的光谱重叠(表1)。在每个构建体中,将3份荧光蛋白拷贝融合给框架伴侣,其定位荧光团的定位,从而使特定结构标记(表1)。将每个构建体侧翼用CMV启动子(以驱动高级表达),然后将多个信号(以终止转录)和四个构建体组合以产生单个多函数15kb插入物。然后引入最终的构建体赫拉细胞(图1)。得到的HeLa细胞显示了强大的标记,每个荧光团在各自的亚细胞结构上都有很强的表达和检测(图1)。在这里,mx Chaining让研究人员能够生成四种最初的独特结构,然后将所有四种结构组合成一个15kb的插入物。

表1:用于标记蜂窝结构的MXS构建体

构造 荧光团 激励/发射最大值 拘束的伴侣 亚细胞本地化
1 Tagbfp. 399nm / 456nm. 组蛋白2 b (H2B) 染色质
2 蔚蓝的 433nm / 475nm lyntag(来自酪氨酸蛋白激酶Lyn)
3. 麦克里 587nm / 610 nm 人β-肌动蛋白
4. 黄水晶 516海里/ 529海里 人类α微管蛋白 微管蛋白


可重复,定向克隆

MXS-Chaine套件的内容

MXS-Chaine背后的原理是可重复的,限制酶(基于链接)克隆。模块(图2)包含在单个质粒中,每个质粒均由相同的多克隆部位(MCS)侧翼。模块一次按标准组装一个限制酶消化,然后是结扎。结扎后,在每个结扎产品的侧翼再生MCS的原始模式,这是该方法可重复性的基础。需要注意的是,MCS的酶切位点仅在结扎产物的5’和3’端再生,模块之间的酶切位点在结扎后被消除。因此,一旦两个模块组装在一起,第三个模块不能放在它们之间,只能使用新生成的MCS添加到5 '或3 '端。mxs链接还具有方向性的优点,这意味着(在前面的示例中)可以控制第三个模块是添加到连接产品的5 '端还是3 '端。

与其他高通量克隆策略的比较

有几种可用于组装这些模块化的构造的高通量克隆策略,并且不同的方法适用于特定的下游应用。各种克隆方法之间的权衡列于表2中。例如,基于链接的克隆方法要求使用这些技术组合的单独模块是没有特异性限制酶识别位点。因此,链接方法不一定适合于组合内源性序列。

表2:高吞吐量克隆策略

方法 技术 优点 缺点 参考文献
金门 II型限制酶 可以在单个步骤中组装最多10个模块。通过迭代这一步骤,最终构建体可以包含无限数量的模块。 根据模块的顺序约束,因为邻近的片段需要兼容的粘性结束 Engler等人,2008
吉布森克隆 吉布森装配方法 单反应,可以组装大的DNA序列,不需要限制性内切酶 不适合连接具有高度同质性的序列,因此不适合产生含有多个相同聚腺苷化信号或启动子的多顺反子 Gibson等人,2009年
MXS-Chaine.生物积木,Bglbricks等等。 基于链的方法(基于限制性酶)。 非常适合高度相似或重复序列的模块化装配。中间链产品(称为“磁带”)可以很容易地在任何稍后构造的组装中重用(即,功能磁带是可回收的) 只有在模块本身未发现用于组件的限制性站点(因此可能不适合内源编码序列),只能工作,因此酶选择是至关重要的。可能不支持编码序列的内框架融合

Sladitschek和Neveu, 2015;Shetty等人,2008;安德森等人。,2010年


MXS链接方法的原理在基于链的方法中,所使用的特定限制性酶会影响可以组装的模块的一般类型。例如,因为CpG二核苷酸的大多数脊椎动物基因组(Josse et al ., 1961年,斯沃茨et al ., 1962),萨利·,XhoI和MluI识别网站,其中包含CpG个六的二核苷酸序列,很少发现这些物种的转录组,通常可以用来克隆的互补。然而,这些酶可能不适用于从具有高CpG二核苷酸表达的生物体中克隆基因。表3列出了各种链克隆方法中使用的特定限制性内切酶。

高通量克隆的目的是促进多组分质粒的构建。mxs -链方法的创造者已经使用该技术在哺乳动物细胞培养系统中应用流式细胞术方法构建各种结构(他们的最初目标)。他们的工作已经证明了mxs链接方法可以用于健壮、快速和简单地构建这些类型的构造。我们希望您也可以将mx链接应用到您的实验需求中。让我们知道你如何使用mx链通过电子邮件我们blog@addgene.org.

表3:基于链接的克隆方法

方法 限制性内切酶
链接 方向
MXS-Chaine. 萨利·和XhoI MLUI.
Biobricks. SpeI和XbaI EcoRi和Psti.
Bglbricks bglii和bamhi. eCORI.


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参考文献

1.Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, Wu GC, Goler JA, Arkin AP,等。BglBricks:用于生物部件组装的灵活标准。生物工程杂志。2010; 4(1): 1。PubMed.PMID: 20205762。pmed中央PMCID:PMC2822740

2.一锅,一步,高通量的精确克隆方法。PloS one。2008; 3 (11): e3647 doi: 10.1371 / journal.pone.0003647。PubMed.PMID:18985154。pmed中央PMCID: PMC2574415

3. Gibson DG,Young L,Chuang Ry,Venter Jc,Hutchison Ca,Smith Ho。DNA分子的酶组装高达数百千碱基。自然方法。2009年。6(5):343-345。PubMed.PMID:19363495.

4. Josse J,Kaiser Ad,Kornberg A.脱氧核糖核酸的酶合成。VIII。脱氧核糖核酸最近邻碱序列的频率。生物化学杂志。1961年3月; 236:864-875。PubMed.PMID: 13790780

5.Shetty RP, Endy D, Knight TF。工程生物砖载体从生物砖部分。生物工程杂志。2008; 2:5。PubMed.PMID: 18410688。pmed中央PMCID: PMC2373286

6.Sladitschek HL, Neveu PA。mxs - chains:一个用于哺乳动物系统中成像和流式细胞术方法的高效克隆平台。公共科学图书馆。2015年4月24日;10(4):e0124958。PubMed.PMID: 25909630。pmed中央PMCID:PMC4409215

7. Swartz Mn,Trautner Ta,Kornberg A.脱氧核糖核酸的酶合成。XI。进一步研究脱氧核糖核酸中最近邻碱基序列。生物化学杂志。1962年6月; 237:1961-1967。PubMed.PMID: 13918810

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