支原体污染:它来自哪里以及如何防止它

客人的博客

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这篇职位由Guest Blogger,Kaustubh Kishor Jadhav是MGMS Biosciences of Technoloctions研究所的一家研究助理。

如果您正在阅读本文,那么您可能怀疑您的细胞文化中的支原体污染,或者您即将开始新的细胞文化项目。如果您的实验室存在mycoplasmas,请不要惊讶。它们存在于大多数细胞培养设施中,组织培养实验室和每个细胞培养师都必须处理这个问题。据估计,支原体负责高达30%的细胞培养污染(Uphoff,2002)。

支原体被认为是最简单和最小的细菌之一。没有刚性细胞壁使它们耐抗生素和青霉素和链霉素等抗菌药物。支原体可以通过过滤方法,因为其能够改变形状和不存在刚性细胞壁。在这里,我将在进入您的细胞文化之前涵盖一些最佳方法来解决支原体污染,如果您遇到支原体污染,该怎么办。

支原体污染的原因

支原体通过各种难以追踪的来源进入细胞培养。这些包括实验室人员、血清、细胞培养基、水浴、培养箱等。人类污染是上述污染源中最大的一个。污染物可以通过脏衣服、实验室穿的衣服、层流附近的人类语言、人类头皮、打喷嚏、咳嗽等方式传播。此外,在细胞培养物保存的地方,持续不断的个人流动将增加污染的风险。

支原体可以通过交叉污染和拙劣的实验室技术从这些来源传播。这包括对多个细胞系重复使用移液管,而不是使用一次性移液管或重复使用手套。血清也是支原体污染的来源之一。由于其浑浊的性质,在每一种细胞培养最常用的血清中很难检测到污染。每次传代时重复使用同一瓶血清可促进支原体的生长。血清营养丰富,是支原体增殖的最佳来源。另外,它是在高压灭菌后添加到培养基中,因此不能保证血清是无污染的。

在层流气流工作期间产生(谈话或移液时)的气溶胶也是污染的主要原因。产生的这些气溶胶将在传代培养过程中或如果细胞系保持较长时间暴露,则在传递过程中或空气中进入培养基。气溶胶对肉眼看不见,因此不能检测到它导致污染。

问题的另一个来源是用于传递的介质,其以液体和粉末形式可用。由于处理不当或差的实验室技术,支原体可以通过这种形式的粉末介质传播。过滤不能确保完全灭菌,因为支原体甚至可以逃脱0.2微米过滤器。

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图1:污染!组织培养基通常具有包含在培养基中的指示剂,其由于微生物污染而从降低的pH从降低的pH变化。照片由Kaustubh Kishor Jadhav。

mycoplasmas可以保持在干燥状态较长的时间。当它们与营养源接触时,它们不久就开始增殖。一旦它们存在于实验室环境中,它们难以消除。您可以抑制支原体的生长,但不能完全消除它。当在文化中看到支原体时,丢弃烧瓶是一个很好的选择(除非文化来源是不可替代的或非常昂贵的)。

检测支原体污染

用肉眼或光学显微镜检测支原体是非常困难的,所以你怎么知道它在那里?对于这项任务,你可以使用基于PCR的检测,DNA染色,荧光标记,琼脂镀等。明智地选择下面列出的任何一种技术,并总是使用第二次检测以100%确定。在检测支原体之前,细胞应连续培养至少两周为生长的低水平污染提供时间。对于测试,在抽样前至少两到三天更改介质(Uphoff和Drexler,2011)。

  • 在琼脂平板/肉汤中培养被认为是检测支原体的“金标准”。在该方法中,将来自细胞培养物的上清液加入液体或半固体培养基中(含有支原体生长必需的营养物质)。受感染的细胞培养将显示在液体肉汤和琼脂平板上的生长。在琼脂平板上易于看到支原体菌落。这种方法能够除以少数几种,能够检测大部分支原体物种。
  • 另一种检测支原体的方法是PCR。该技术采用针对各种常见感染支原体16s RNA基因的PCR引物。广泛的引物包括几乎所有的感染支原体。该过程中使用的引物可以是物种/基因特异性的,也可以是通用的。该方法快速、高效、可靠、性价比高(Sung, 2006)。
  • 这种基于传感器细胞的方法使用了特殊的细胞,可以检测培养物中支原体的存在。一旦这些细胞检测到支原体,它们就会触发一系列的化学反应,从而引起明显的颜色变化。这种方法有高灵敏度但特异性低(脱胶,2012)。
  • 生物发光检测试剂盒可从不同的生物技术公司,其中酶为基础的支原体检测试剂盒。这些试剂盒可以检测非真核细胞合成的支原体酶。首先,试剂盒组件使支原体破裂,然后使用特定的酶触发产生发光的细胞机制。这可以被一个光度计检测到。
  • 在感染培养基中加入非特异性DNA染色检测支原体。在荧光显微镜下观察,除细胞DNA外,支原体DNA以小簇的形式出现。
  • 荧光DNA染色是另一个DNA染色替代方案。该方法使用DAPI和Hoechst 33258等DNA污渍染色所有DNA。在这个过程中需要一些专业知识,因为结果解释可能很困难。支原体的低密度,由这些细菌产生的其他细菌或细胞外荧光信号的污染可以阻碍正确的结果解释。此外,来自核区域的信号使得重用的药物困难(Ligasová,2019)。

预防支原体污染

避免支原体的最好和最重要的方法是对在实验室工作的人员提供适当的培训和指导。这可以通过培训合格的工作人员进行细胞培养过程,从而消除污染的原因之一。如果可能,应提供一个单独的实验室进行细胞培养和细胞系的维护。为实验室设施提供这样的环境不仅可以减少支原体,还可以避免其他细菌和真菌的污染。

适当的个人防护用品

由于人类是污染的主要来源,因此预防步骤从您开始。如果您对工作提供无菌环境,请注意,在您实现它之前,它将很快成为一种习惯。以下是一些事情要做:

  • 处理细胞系的同时穿清洁实验室外套和面具。
  • 避免与其他实验室成员进行讨论,在实验室中打喷嚏或咳嗽。人口含有各种各样的支原体,当你谈话,笑,打喷嚏或咳嗽时,这些都可以进入细胞文化。
  • 工作时戴上手套,用后丢弃。当你工作时不戴手套或口罩,人类接触会传播污染。一定要定期更换手套和口罩,而不是把它们放在你的实验服口袋里。
  • 为实验室分开鞋类,以避免带入环境污染物。
Addgenie在组织培养罩工作时戴上实验室外套,手套和面膜。
图2:Addgenie在戴PPE的同时在组织培养罩中工作。照片作者Kate Harten Demaio。

细胞系和试剂

  • 在使用前检查您的蜂窝线库存中的支原体污染。
  • 确保血清中没有污染,用于传代培养。避免使用已储存较长时间的过期产品或试剂。
  • 尽可能使用新鲜介质,并将其紧密包装在一起。
  • 使用一次性移液器以避免交叉污染。
  • 确保在您工作之前和虽然在工作前持续所有所需的设备和试剂。
  • 在使用细胞系进行测定或分析目的之前,对支原体污染进行常规检查。
  • 使用0.1微米过滤器,原样是避免支原体的更好方法,而不是使用0.2微米过滤器进行介质过滤。没有100%保证这个过程可以避免污染,但这是一个非常好的预防做法。
  • 准备少量用于实验的培养基,防止污染其余的培养基。
  • 避免长时间曝光细胞培养到空气,并确保在将它们放入培养箱之前拧紧瓶盖。这也将解决通过气溶胶的污染问题。
  • 在不使用抗生素的情况下进行培养,因为使用抗生素会导致支原体对抗生素产生耐药性。抗生素只能用于去除支原体,而不能用于防止支原体的生长。此外,长期使用一种抗生素可能诱发除支原体以外的其他细菌的耐药性。
  • 即使冷冻保存的细胞的可行性随着每种媒体的降低而降低,始终以冷冻保存的小瓶的形式备份。

设备

  • 定期熏蒸层流气流和实验室设施。
  • co.2用于维持细胞系的培养箱不能被过度拥挤(填充不超过其容量的60%),这可能导致从一个细胞系到另一个细胞系的支原体感染。
  • 由于它增加了交叉污染的风险,多个细胞系不应存储在单个孵化器中。
  • CO2培养箱应定期清洗,应避免任何类型的潮湿。提供以维持湿度的蒸馏水应定期改变为支原体,细菌和真菌可以居住在这些容器中。
  • 清理任何媒体或文化立即溢出。
  • 水浴、液氮容器、试剂瓶等传染源必须定期清洗,并定期检查污染情况。

有关更多提示,请查看addgene的视频在下面的组织文化中入门!

检测后的支原体去除

你发现了支原体污染,下一步怎么办?最好的办法是丢弃被感染的细胞培养瓶。在文化不可替代或非常昂贵的情况下,有一些方法来拯救文化。

消除是一个非常耗时的过程,并增加二次污染其他健康细胞系的风险。支原体去除剂(MRA)是喹诺酮类抗生素的衍生物,是广谱抗生素。这些试剂可以用来清洗培养细胞。根据感染的严重程度,治疗可能需要几周到几个月。plasmoin是一种广泛使用的药物,它可以清除培养基中存在的大多数支原体。还有BM Cyclin、氟喹诺酮环丙沙星、ciprobay、zagam、baytril、四环素等药物可用于从受感染培养物中去除支原体。

MRAs无毒,有效去除大多数支原体污染,易于使用,对广泛的支原体有效。这些方法不能保证完全去除支原体,但可以去除大部分的支原体污染,是最后的选择。考虑这种治疗有一些缺点,因为治疗的时间会影响细胞的生长和生存能力。如果支原体对细胞培养物造成永久性损害,则是不可修复的。有些细胞可能会因长时间的孵育而死亡,从而影响细胞的总活力。

结论

总而言之,预防污染比根除污染更重要。当支原体感染你的细胞培养物时,不要害怕,因为你不是第一个面临这种问题的人。尽可能地教育他人,帮助他们了解预防污染的重要性。要意识到这一点,而且要谨慎,而不是通过艰苦的方式来学习!

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Kaustubh Kishor Jadhav爆头非常感谢客座博客Kaustubh Kishor Jadhav!

KAUSTUBH KISHOR JADHAV,MSC是印度MGMS生物科学研究所的研究助理。Jadhav在硕士学位(米兰,意大利大学)和生物技术学士学位有硕士学位。

参考文献

Degeling MH,Maguire CA,Bovenberg MSS,Tannous BA(2012)哺乳动物细胞培养中的支原体检测的敏感测定。肛门化学84:4227-4232。https://doi.org/10.1021/AC2033112

Ligasová A, Vydržalová M, Buriánová R, Brůčková L, Večeřová R, Janošťáková A, Koberna K(2019)荧光显微镜检测支原体的新方法。细胞8:1510。https://doi.org/10.3390/cells8121510

Sung H, Kang SH, Bae YJ, Hong JT, Chung YB, Lee CK, Song S(2006)支原体的pcr检测。微生物学杂志。44:42-49

Uphoff Cc,Drexler Hg(2002)比较抗生素从连续细胞系中删除支原体感染。体外细胞驱动Biol Anim 38:86。https://doi.org/10.1290/1071-2690(2002)038,10086 :caeomiely2.0.co;2

Uphoff Cc,Drexler Hg(2011)通过聚合酶链反应检测细胞培养物中的支原体污染。在:分子生物学中的方法。Humana Press,PP 93-103

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