意大利面怪物的神经元标记

由Benoit Giquel

Benoit Giquel

意大利面条怪物蛋白结构

中枢神经系统(CNS)协调复杂的过程,使生物体能够控制它们的运动和行为。这些功能和其他功能都是由神经元集合控制的,这些神经元通过突触连接错综复杂地连接到电路中(牧羊人,2004)。了解这些神经回路的结构和功能对神经科学研究至关重要。利用基因工具来可视化和扰乱神经回路,再加上将基因传递到中枢神经系统的方法的发展,使得绘制这些神经元网络变得更加容易。

近三十年来,重组腺相关病毒(AAV)由于其低细胞毒性、低免疫原性和AAV传递基因的长期表达,已被广泛应用于将基因工具传递到大脑。AAV血清型已被广泛研究,以确定那些目标特定的神经元群体在大脑。的艾伦研究所Janelia研究校园在美国已经使用AAV1和AAV2血清型来创建一个小鼠大脑图谱。这个图谱使研究人员能够快速找到最佳的AAV血清型,以瞄准他们正在研究的神经元。多亏了这项工作,现在在你最喜欢的神经元群体中表达分子和追踪与该群体的联系就容易得多了。

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常见的遗传编码神经元示踪剂的局限性

诸如表位标签的神经元示踪剂和伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白(FP)在映射,监测和操纵神经元电路方面也很重要。表位标签是附着于感兴趣蛋白质(POI)的短抗原肽序列,其促进特异性特异性抗体的免疫组织化学(IHC)实验。最着名的是流感血凝素(HA),髓鞘病病毒性癌基因(MYC),Simian病毒5衍生的表位(V5),合成肽标志,合成链霉抗生物素蛋白结合绞标签,最近,最近,ollas(大肠杆菌OmpF链接器和小鼠langerin)和Sun Tag (Viswanathan 2015)。

抗原表位标记用于免疫组化的主要优势是可获得可靠的一抗进行检测,特别是当POI的抗体是非特异性的、与其他抗体发生交叉反应或完全不可用时。另一个优点是这些标签很小(8-12个氨基酸),既不会干扰POI折叠,也不会干扰其与细胞内的蛋白质伙伴相互作用的能力。然而,抗体对这些标签的亲和力很低,当POI弱表达时,即使是多聚标签也常常不足以检测。由于这些表位标签没有固有的视觉信号,因此不能在活体成像实验中直接检测到。因此,很难使用表位标签来监测单个分子——例如,研究人员经常想在神经元突触上做的事情。此外,这些标签需要融合到支架蛋白,以便在神经元中稳定表达。

与表位标记相比,FPs本身具有荧光性质,因此可以用于研究神经元回路和动力学的活体成像实验。FPs通常是明亮的,稳定的,细胞耐受良好。它们可用于蛋白质定位、分离和跟踪实验(Rizzo,2009)。由于在可见光谱中有许多不同的FPs发射,研究人员也可以在单个实验中使用多个FPs,同时可视化许多分子或结构(的沙,2007)。与表位标签相比,FPs更大,它们与POI的融合可以影响蛋白质折叠和蛋白质间的相互作用。此外,FPs的过表达可以引发蛋白质聚集,这对细胞是有毒的,并影响标记小结构,如神经突起。与表位标签一样,低FP表达可能不足以监测弱表达的POI。

意大利面条怪物-一个新的和改进的神经元示踪剂

随着表位标签和荧光蛋白的局限性,开发能够精确标记神经元的特性至关重要。伟德2021足球欧洲杯买球平台如上所述,弱表达蛋白质尤其难以与这些经典探针追踪。克服现有FP和表位标签的局限性,研究人员罗兰Looger的实验室已经开发了结合两者优点的新的分子标签(Viswanathan, 2015)。对于Looger的团队来说,理想的探针应该结合FPs的溶解度、细胞耐受性和选择性荧光与表位标记的容易抗体识别。因此他们创造了抗原蛋白标签“意大利面怪物”荧光蛋白(smFPs)伟德2021足球欧洲杯买球平台。SMFPS实际上由融合到多个表位标签的FPS组成。实际上,为了创建smFPsLooger的团队有策略地将10到15个单表位标签的拷贝插入到单个FP支架中,这些FP支架要么是完整的,要么是染色团变暗的。这些探针本质上都是荧光的,可以检测高表位特异性,荧光标记抗体。

“意大利面怪物”的名字是指社会运动的神,飞行意大利面怪物教堂;smFP结构类似于神的图像(参见上面的对比图)。飞行意大利面怪物教堂是它是反对在公立学校教授智能设计的标志,由俄勒冈州立大学物理学毕业生博比·亨德森于2005年在堪萨斯州发起。

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使用SMFPS.

1.多渠道connectomic示踪剂

多色的带来与smfps

伟德2021足球欧洲杯买球平台长期以来,荧光蛋白(如GFP)一直被用作研究连接组学(神经回路如何组织以及神经元如何相互连接)的探针。与aav结合后,FPs可在脑内轻松表达,并可通过直接荧光信号或使用抗fp抗体进行检测。

GFP只在一个通道发出光。在多色成像实验中,第二种颜色通常由红色荧光蛋白如tdTomato或RFP或蓝色荧光蛋白如Cyan提供。伟德2021足球欧洲杯买球平台这些FPs的问题是它们的光稳定性不如GFP。此外,基于抗体的信号放大较弱,增加了背景荧光。此外,许多FPs具有细胞毒性,容易聚集并与抗gfp抗体发生交叉反应,使得它们难以在多色/多通道成像装置中使用。相比之下,smFP标签可以被具有非常特异性反应的独特的荧光标记抗体识别,这使得它们比标准FPs更适合用于多色成像实验。因此,Looger实验室能够轻松地使用smFPs和标准神经元示踪剂进行四色标记实验。

2.神经元亚细胞结构的可视化

GFP的能力有限于标记CNS中的亚细胞结构。GFP和其他FPS具有倾向于明亮地标记Somata但不是神经元过程。相比之下,SMFP可以标记具有高保真度和低于GFP的微观神经元结构。SMFP通过它们的多重抗体的多个高亲和力结合位点使得能够更好地标记这些细结构,其可用于在子蜂窝结构内扩增直接SMFP信号。例如,SMFPS已被用于可视化海马CA3金字塔神经元中的“棘手的赘肉”(TE)刺,该神经元已知是难以难以标记的。还显示出枝形的地层方位地层lacunosum moleculare最好得到解决与smFP_FLAG比GFP。

3.增强区分弱表达和/或类似蛋白质的能力

通过其多重、高度特异性的抗体结合位点和基于初级抗体的检测,smFPs为弱表达蛋白创造了比标准标签更亮的信号,并可用于区分高度相似的蛋白。例如,n-钙粘蛋白(cadherin-2)是一种突触后细胞粘附蛋白,在神经发育中起着关键作用。它属于一个巨大的蛋白质家族,在序列上非常相似,因此很难用标准抗体来区分。通过将n -钙粘蛋白融合到smFPs中,Looger团队能够特异性地标记神经元中的n -钙粘蛋白,并表明smFPs融合比融合到3个或更多HA标签提供更好的标记。

4.高分辨率显微镜

如上所述,SMFP可以与常规显微镜一起使用,例如离荧光或共聚焦显微镜,但它们也可以与最尖端的成像技术,如阵列断层扫描,超分辨率风暴成像和电子显微镜。这些技术的样品制备有时会使使用抗体检测蛋白质标签更难。相比之下,随着它们的许多表位,SMFP比样品制备比标准蛋白标签如GFP更好地保留它们在样品制备后检测的能力。专门针对风暴,SMFP提供的高强度信号可导致更好的分辨率图像。

结论

通过组合FPS和表位标签的优点,SMFPS似乎是非常有效的探针,用于细化亚细胞结构或低丰度蛋白。当用AAV提供时,这些探针可用于标记通常难以看待的神经元电路和结构。SMFPS是一个很好的附加加载到神经科学家的工具套件,用于研究大脑,我们期待未来扩大SMFP的使用。


参考

1. Viswanathan,Sarada等。“光和电子显微镜的高性能探头”。自然方法12.6(2015):568。PUBMEDPMID:25915120。公共医学中心PMCID:PMC4573404

2.牧羊人,通用(2004)。在“突触大脑的突触组织”。牛津大学出版社,纽约。页719。

3.里佐,马克·A,迈克尔·w·戴维森,大卫·w·活塞。"荧光蛋白跟踪和检测:荧光蛋白结构和颜色变异"冷泉港协议2009.12 (2009): pdb-top63。PubMed.PMID: 20150100

4.沙纳、内森、乔治·h·帕特森和迈克尔·w·戴维森。"荧光蛋白技术的进展"细胞科学杂志120.24(2007):4247-4260。PubMed.PMID:18057027

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