光遗传学+ CRISPR,利用光控制基因组编辑

Caroline Lamanna.

最初发布于2016年3月8日,最后更新了9月3日,2020年9月3日尼瑙奈曼。

自2012年CRISPR技术首次应用于基因组工程以来,世界各地的科学家一直在对其进行重大改进。许多这些进步都源于减少Cas9脱靶活动的目标。使用nickases、引物编辑、抗crispr蛋白和其他技术都是为了提高靶向特异性或缩短Cas9活性的持续时间。

致光学领域以实现精确的时间和空间控制而闻名。光遗传学利用基因编码工具,如微生物视蛋白,利用光控制细胞活动。2015年,科学家将CRISPR和光基因技术结合起来,开发了多种光激活CRISPR工具。这些工具允许科学家利用光从外部控制基因组编辑过程的位置、时间和可逆性。继续读下去,了解研究人员可以使用的各种光控CRISPR工具——其中一些可以在Addgene上找到。

在addgene中找到Optimetics质粒

使用DCAS9闪耀着转录激活的光线

2015年初发表的最初的光激活CRISPR系统专注于利用光来控制转录。两个独立的实验室,莫里斯科佐藤的实验室在东京大学查尔斯Gersbach的实验室在杜克大学基于光诱导的异二聚化密钥化2(Cry2)和钙和整合蛋白结合蛋白1(CIB1)蛋白质开发的类似系统。两组的目标是创建一个系统,该系统将在赋予SP的同时使用光线开启和关闭基因表达AtiTemporal控制,可逆性和可重复性。

SATA实验室开发的系统由两种融合蛋白组成:1)基因组锚点-与CIB1融合的失活、死亡Cas9蛋白(dCas9);2) CRY2光解酶同源区(CRY2PHR)与一个转录激活域(VP64或p65)融合。在细胞中表达后,dCas9-CIB1融合蛋白在引导RNA (gRNA)的引导下与目标DNA序列结合,而cry2phrh -activator融合蛋白则自由浮动,如下图所示。一旦被蓝光触发,CRY2和CIB1蛋白异二聚,并将激活物移动到相应位置,激活基因转录。研究人员测试了多种组合来优化这两种融合蛋白。表现最佳的组合为NLS-dCas9-trCIB1和nlsx3 - cryphra -p65 -在暗状态下本底活性最低,31X时的倍数诱导率最高。通过在蓝光照射下(470nm)使用狭缝模式,研究人员发现人类ASCL1基因的表达可以在空间上以可逆和可重复的方式进行控制。

和他们的光激活CRISPR / CAS9效应器(鞋带)系统, Gersbach实验室利用类似的策略开发了一个优化的光激活CRISPR基因激活系统,但确定了一个不同的最优融合蛋白组合。优化后的蕾丝系统包括:1)CIBN-dCas9-CIBN,其中CIBN为CIB1的N端片段,融合在dCas9的N端和c端;2) CRY2FL-VP64,由全长CRY2和转录激活因子VP64域融合而成。在HEK293T细胞中使用该系统诱导人IL1RN的表达,研究人员发现2小时后mRNA水平增加了11倍,30小时后增加了400倍。在450nm蓝光照射下,系统具有可逆性和可重复性。利用狭缝掩模,研究人员还展示了空间控制基因表达的能力。

这两种技术都利用了光诱导的二聚化来激活它们的CRISPR系统。这种常见的致敏技术可用于其他分裂系统,其中需要重新酶活性。

使用分割系统的NHEJ和HDR由NHEJ和HDR的可光激活基因组修改

2015年后,佐藤实验室推出了一个可光激活的系统切割靶DNA序列(Nihongaki等,2015)导致双股突破(DSB)可以通过非同源终端连接(NHEJ.)或同源性定向修复(HDR)。该系统的独特之处在于它利用了一种“分裂”核酸酶——作者将Cas9分裂成n端(残基2-713,N713)和c端(残基714-1368,C714)两半,使Cas9在分裂时无功能,但在两半重新结合时恢复功能。通过将光诱导的异二聚结构域融合到每个Cas9片段上,作者创建了一个光活性Cas9工具,如下图所示。他们最成功的设计磁铁照片开启蛋白质来自真菌感光体,生动(VVD,N.Crassa)(Kawano等,2015)。绰号Pacas9-1并由融合蛋白N713-PMAG和NMAGHIGH1-C714组成,这种新系统既有低背景和高折叠诱导CAS9活性(16.4倍)。该PACAS9-1光诱导系统能够识别相同的PAM,并具有与全长CAS9(FLCAS9)相似的靶向特异性。当由蓝光(470nm)引发时,PACAS9-1通过NHEJ(频率为20.5%)诱导诱导突变,并通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。

作者另外表明,它们可以通过使用NMAGC714而不是NMAGHIGH1-C714来改变PACAS9-1来降低系统的背景活动。这种变化没有显着改变系统em在光和低背景dsb(不可检测)激活时产生突变的效率。和他们之前的工作一样,佐藤实验室也表明paCas9-2系统可以通过开启和关闭蓝光进行空间控制和可逆激活。

正如人们从Cas9的模块化特性可以预料到的那样,Nihongaki等人表明,在它们的分裂融合中交换Cas9结构域并产生光激活蛋白是可能的尼斯和一个可光激活的压制者(DCAS9)。所有变体的活动是可逆和可重复的。

分裂的光遗传系统用蓝光激活CRISPR活性

由于2015年发布的这些初步研究,已经开发了更多的分裂系统,用于与基于CRISPR的基因编辑一起使用(见下表)。例如,远红外光激活分裂- cas9 (FAST)系统组成型表达Cas9的c端片段,而n端转录则依赖于光(Yu et al., 2020)。为了表达N-Cas9, Haifeng Ye的实验室使用了细菌光敏色素BphS,该BphS在远红光(730 nm)作用下产生c-di-GMP。这个核苷酸触发BldD蛋白转位到细胞核。为了将这种依赖光的活性与转录结合,他们将BldD与转录激活因子p65和VP64融合,而这两种激活因子反过来转录N-Cas9。N-和C-Cas9片段分别与高亲和力的相互作用蛋白Coh2和DocS融合,二聚形成功能蛋白。

自蓝光在体内有限的应用中,使用远红光的使用特别令人兴趣。紫外线和蓝光易于被皮肤吸收和散射,因此无法达到更深的组织。另外,高强度暴露会导致DNA损伤。然而,远红光可以穿过皮肤表面5毫米,并且较少的光毒性。使用快速系统,YE的实验室可以使用编码快速构建体的Minicircle DNA载体编辑小鼠中的TDTomato荧光报告基因。该概念验证模型打开了在动物模型中基于CRISPR的系统的致敏性操纵的诱人可能性。

使用防克隆来关闭基因组编辑

单链Cas9光电开关

CAS9的光激活也可以使用单链融合蛋白来实现通过将CAS9融合到光感受器来实现。一个主要例子来自实验室迈克尔•林,谁开发了一个一种嵌合蛋白,由Cas9和一种可光分解的绿色荧光蛋白二聚体组成(PDDRONPA)(周等人,2018年)。Pddronpa二聚体响应青色光(500nm)而解散。通过将两个pddronpa结构域融合到侧翼的基点,荧光结构域在黑暗中二聚化并防止DNA结合。在光线刺激后,PDDRONPA部分分开,允许DNA结合和切割。该技术被应用于创建可切换spCas9, dCas9和金黄色葡萄球菌Cas9 (saCas9)蛋白质,显示了这种方法的多功能性。这项研究产生了第一个光学活性的saCas9蛋白。

单链光活性Cas9与青色光有效

别光!光活性抗crisprs抑制了Cas9的活性

抗crispr蛋白是一种能够阻断CRISPR-Cas系统的高度多样化的蛋白质。它们已被用于阻断基因组编辑、减少脱靶活性和防止细胞毒性作用。更多详细的评论,请查看我们的博客文章:抗crispr蛋白关闭CRISPR-Cas系统

听听反crispr的播客部分


当Cas9的活性被阻断时,单纯表达抗crispr蛋白并不能提供太多的控制。因此,利用光基因技术可以更精确地控制Cas9的活性。Dominik Niopek的实验室实现这一点,将抗克切者ACR蛋白,ACRIIA4融合到光敏LOV2域来自A. Sativa(Bubeck等,2018)。Lov2有一个C终端螺旋,在蓝光刺激时展开。当融合到Acria4的催化部位时,这种展开构象变化可能会干扰活性。通过acria4的新型致敏变体,将所得系统造成Crisp-Cas9活性切换(卡萨诺瓦)。如下图所示,在没有光的情况下,CAS9受Acria4的结合并呈现不活动。在蓝光存在下,acriia4被展开的爱情抑制,允许释放Cas9。

CASANOVA系统的一个值得注意的应用是它在光介质的Crispr贴标,以研究染色质建筑(Hoffman等人,2020)。荧光dCas9蛋白可用于识别特定的基因组位点,用于成像技术。由于dCas9的表达可以潜在地改变基因组和染色质结构,因此调节dCas9结合发生的时间是有用的。Bubeck等人在U2OS细胞中表达了一种端粒靶向gRNA和一种带有三个红色荧光标记的dCas9融合蛋白。光激活后,dCas9在几分钟内释放,20-40分钟后形成红色焦点。CASANOVA系统是多功能的,它可以调节基因编辑、转录、标记染色质和研究动力学。

光活化的抗克隆蛋白与蓝光有效

使用化学对复印机克切

上述技术各自采用了肌肤的光活性策略另一方面,从天然存在的光活性蛋白(即Cry2和Vivid) - 亚历山大Doiters'实验室采用了不同的方法。这些研究人员使用了遗传编码复印技术插入一个可拆卸的保护组,特别是硝基苄基复印赖氨酸(PCK),在Cas9蛋白上(Hemphill等人。,2015)。为了将PCK插入CAS9上的特定站点,该组使用了一个工程化吡咯唑酯TRNA / TRNA合成酶对在到达琥珀色停止密码子TAG时添加PCK。(要了解更多关于利用吡咯酰tRNA合成酶对氨基酸进行位点特异性掺入的知识,阅读这篇文章)。

该组首次测试CAS9中的各种赖氨酸,以确定哪种最佳丧失蛋白质裂解靶向DNA的能力,如下图所示,沉淀在光刻K866赖氨酸上。接下来,通过使用双重记者荧光测定,Hemphill等人。证明Cas9k866pck突变体在用UV光(365nm)照射之前确实无活​​性,并且紫外线暴露于其显示与野生型Cas9相似的切割活性。还示出了这种光刻技术在使用光掩模技术时赋予Cas9切割的空间控制。最后,Hemphill等人。呈现的数据显示,这种遗传编码的复印Cas9系统可以沉默内源基因表达 - 在HeLa细胞中证明光诱导的转移素受体CD71的沉默。

用紫外线从Cas9释放光固化化学品。此时Cas9激活

可比较的光激活CRISPR策略

出版物 系统昵称 Photoactivatable一半 Cas9 variatn CRISPR蛋白质的应用
分配系统/光引起的二聚化
Nihongaki等人,2015 拟南芥CRY2和CIB1 dCas9 基因转录激活
Polstein等人。,2015年 花边 拟南芥CRY2和CIB1 dCas9 基因转录激活
Nihongaki等人,2015 paCas9 从N. crassa Split Cas9, Split Cas9 nickase, Split dCas9 NHEJ和HDR的基因组编辑,Crispri抑制基因表达
Nihongaki等人,2017 分裂CPTS2.0. 拟南芥CRY2和CIB1 dCas9 基因转录激活
Kim等人,2019年 LADL 拟南芥CRY2和CIB1 dCas9 基因转录的激活。标签基因位点。改变染色质结构。
Yu等人,2020年 快速地 来自R. Sphaeroides的BPHS 拆分Cas9. NHEJ和HDR的基因组编辑。可用于体内型号
单链光学性能Cas9
Richter等人。,2016年 TSRC9. Rslov来自R. Sphaeroides Cas9,DCAS9. 基因编辑
Zhou等人,2018 pddronpa. Cas9,DCAS9. 基因编辑,转录
轻依赖性防克隆
Bubeck等,2018年 卡萨诺瓦 来自A. Sativa的LOV2 Acria4抗CRISPR蛋白,与CAS9或DCAS9共同表达 抑制基因编辑和转录。标签基因组基因座
光化学控制
Hemphill等人。,2015年 硝基苄基赖氨酸 Cas9 K866PCK突变体 NHEJ和HDR的基因组编辑
Jain等人,2016 Crispr-Plus. 光纤维可爱的SSDNA寡核苷酸 CAS9,复印GRNA 基因编辑
Manna等人。,2019年 NPPOC-caged甲氧苄氨嘧啶(TMP) Cas9融合到破坏稳定的域名(Cas9-DHFR) 基因编辑,转录
周等人,2020 NPOM-caged碱基 CAS9,复印GRNA 基因编辑

要了解更多细节,请查看这个综合评论比较致敏CRISPR技术(Matony等人,2020年)。无论你是想激活、抑制还是修改一个基因,你现在都有了利用光来控制你的基因组编辑的工具。随着CRISPR和光遗传学的不断发展,我们期待更多的工具,并迫不及待地想看到未来你使用这些工具的酷应用!


参考

Bubeck F, Hoffmann MD, Harteveld Z, Aschenbrenner S, Bietz A, Waldhauer MC, Börner K, Fakhiri J, Schmelas C, Dietz L, Grimm D, Correia BE, Eils R, Niopek D(2018)用于CRISPR-Cas9光遗传控制的抗crispr蛋白。Nat方法15:924-927。https://doi.org/10.1038/s41592-018-0178-9

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