Optimetics + Crispr,使用光来控制基因组编辑

由卡洛琳LaManna

最初发表于2016年3月8日,最后更新于2020年9月3日,由Nyla Naim撰写。

自2012年的基因组工程初始应用以来,世界各地的科学家一直对CRISPR技术进行了重大改进。其中许多进展源于减少偏离目标CAS9活动的目标。使用凝血酶,素编辑,抗CRISPR蛋白和其他技术均旨在改善靶向特异性或降低CAS9活性的持续时间。

光遗传学领域以实现精确的时间和空间控制而闻名。Optimetics.使用遗传编码的工具,例如微生物OPSINS,使用光控制蜂窝活动。2015年,科学家合并了CRISPR和致光学技术,开发各种可光激活的CRISPR工具。这些工具允许科学家使用光来从外部控制基因组编辑过程的位置,时序和可逆性。继续阅读,了解研究人员可用的各种光控制的CRISPR工具 - 在Addgene中容易发现。

在Addgene找到光遗传学质粒

利用dCas9对转录激活进行研究

首先发布的初始可光激活的CRISPR系统于2015年初,专注于使用光来控制转录。两个单独的实验室,Moritoshi佐藤的实验室在东京大学查尔斯Gersbach的实验室杜克大学基于光诱导异二聚隐色素2 (CRY2)和钙和整合素结合蛋白1 (CIB1)蛋白开发了类似的系统。这两个小组的目标都是创建一个系统,在传授sp时,利用光来开启和关闭基因表达时间控制、可逆性和重复性。

SATA实验室开发的系统由两个融合蛋白组成:1)基因组锚 - 融合到CIB1的无活性,死亡Cas9蛋白(DCAS9);2)活化剂 - 与转录活化剂结构域(VP64或P65)融合的Cry2光解酶同源区域(Cry2phr)。在表达细胞后,DCAS9-CIB1融合与由引导RNA(GRNA)的指示结合到靶DNA序列,而Cry2Phr-Activator融合漂浮在下图中描绘的。一旦被蓝光触发,Cry2和Cib1蛋白质异二聚体并将活化剂移入到位以激活基因转录。研究人员测试了各种组合以优化融合蛋白。最佳性能组合是NLS-DCAS9-TRCIB1和NLSX3-CRYPHR-P65 - 它在31倍的暗状态下具有最低的背景活动和最高折叠诱导。通过在蓝光曝光(470nm)期间使用狭缝图案,研究人员表明,人ASCL1基因的表达可以以可逆和可重复的方式在空间上控制。

与他们的光激活CRISPR/Cas9效应器(蕾丝)系统,Gersbach实验室利用类似的策略来开发优化的光活化CRISPR基因激活系统,但在不同的最佳融合蛋白组合上稳定。优化的蕾丝系统包括:1)CIBN-DCAS9-CIBN,其中CIBN是CIB1的N-末端片段,它与DCAS9的N-和C-TEMINI融合;2)Cry2FL-VP64,全长Cry2的融合和转录激活域VP64。在HEK293T细胞中使用该系统诱导人IL1RN的表达,研究人员在2小时后的mRNA水平增加11倍,30小时后增加400倍。当蓝光(450nm)循环接通时,该系统也被认为是可逆的并且可重复的。使用狭缝光掩模,研究人员还证明了在空间上控制基因表达的能力。

这两种技术都利用光诱导二聚来激活CRISPR系统。这种常见的光遗传技术可用于其他需要光来重建酶活性的分裂系统。

使用分割系统的NHEJ和HDR由NHEJ和HDR的可光激活基因组修改

2015年晚些时候,佐藤实验室推出了一款用于切割目标DNA序列的光激活系统(Nihongaki, et al., 2015)导致双链断裂(DSB),可以通过任一非同源端连接修复(NHEJ.)或同源定向修复(HDR.).该系统是独一无二的,因为它利用“分裂”核酸酶 - 作者分段的Cas9进入N-末端(残基2-713,N713)和C末端(残留物714-1368,C714)半部,使Cas9非功能性当拆分但重新分配一半时恢复功能。作者通过融合光融合,杂于Cas9碎片的每个Cas9碎片,如下图所示。他们最成功的设计利用磁铁照片开启蛋白质来源于真菌光感受器Vivid (VVD, N. crassa) (Kawano et al., 2015)。这个新系统被命名为paCas9-1,由融合蛋白N713-pMag和nMagHigh1-C714组成,具有低本底和高诱导Cas9活性(16.4倍)。该paCas9-1光诱导系统能够识别相同的PAM,并具有与全长Cas9 (flCas9)相似的靶向特异性。在蓝光(470nm)诱导下,paCas9-1通过NHEJ诱导indel突变(频率为20.5%),通过HDR诱导修饰(频率为7.2%)。

作者还发现,用nMagC714代替nMagHigh1-C714修饰paCas9-1,可以降低系统的本底活性,生成paCas9-2。这一变化并没有显著改变系统EM在用光和降低的背景DSB激活时产生突变的效率(未检测到的)。像他们的前勤工作一样,Sato实验室还表明Pacas9-2系统可以通过打开和关闭蓝光来空间控制和可逆地激活。

因为人们可能期望Cas9,Nihongaki等人的模块化。表明,可以在分裂融合中交换Cas9域并产生可光激活的nickase和一个可光激活的抑制因子(dCas9)。所有变异株的活性都是可逆和可重复的。

分体上的致光学系统用蓝光激活Crisprp活动

自这些初步研究于2015年发表以来,更多的分裂系统被开发出来用于基于crispr的基因编辑(见下表)。例如,远红光激活拆分 - CAS9(快速)系统组成型表达CAS9的C末端片段,同时N-末端的转录是光依赖性的(Yu等,2020)。为了表达N-Cas9,海丰叶氏实验室使用了响应于远红光(730nm)的细菌植物植物Bphs,其产生C-Di-GMP。该核苷酸触发蛋白质BLDD对核的易位。为了将这种轻依赖性活动耦合到转录,它们将BLDD融合到转录激活剂P65和VP64,其又转录N-Cas9。然后,N-和C-CAS9片段分别以分别与高亲和力相互作用蛋白COH2和DOCS融合而形成官能蛋白。

由于蓝光在体内的应用有限,因此对远红光的应用尤为重要。紫外线和蓝光很容易被皮肤吸收和散射,所以不能到达更深的组织。此外,高强度的暴露会导致DNA损伤。然而,远红光可以穿透皮肤表面5毫米,而且光毒性较小。使用FAST系统,叶的实验室可以使用编码FAST构建的miniccircle DNA载体在小鼠中编辑tdTomato荧光报告基因。这个概念验证模型为基于crispr的系统在动物模型中的光基因操纵提供了有趣的可能性。

使用反crisprs关闭基因组编辑

单链Cas9 Photoswitches

CAS9的光激活也可以使用单链融合蛋白来实现通过将CAS9融合到光感受器来实现。一个主要例子来自实验室迈克尔林,他开发了一种由Cas9和光可解离二聚体绿色荧光蛋白组成的嵌合蛋白(pdDronpa) (Zhou等,2018)。pdDronpa二聚体在青色光(500nm)下解离。通过将两个pdDronpa结构域融合到Cas9 DNA结合位点的两侧,荧光结构域二聚,防止DNA在黑暗中结合。在光刺激下,pdDronpa部分分离,允许DNA结合和分裂。这种技术被应用于创造Photoswoxable SPCAS9,DCAS9和S.UUREUS CAS9(SACAS9)蛋白质,显示这种方法的多功能性。该研究产生了第一光学活性Saca9蛋白。

单链光活性Cas9在青色光下变得活跃

stop!光活性防CRISPRS HALT CAS9活动

抗CRISPR蛋白是一种高度多样化的蛋白质,能够阻止CRISPR-CAS系统。它们已被用于阻断基因组编辑,减少离药活性,并防止细胞毒性效应。有关更详细的审查,请查看我们的博客文章:防克隆蛋白关闭CRISPR-CAS系统

听取防克里普尔播客段


只需表达抗CRISPR蛋白的抗粘性蛋白在CAS9活动被阻止时没有提供了很大的控制。因此,共同化的光学技术允许对Cas9活性进行更高的精度和控制。Dominik Niopek的实验室这是通过将抗crispr的Acr蛋白,AcrIIA4融合到一个光敏的LOV2结构域来自A. sativa (Bubeck et al., 2018)。LOV2有一个c端螺旋,在蓝光刺激下展开。当融合到吖啶a4的催化位点时,这种展开的构象转移会干扰活性。由此产生的系统被命名为CRISPR-Cas9活性切换通过一个新的光遗传突变的吖啶a4 (卡萨诺瓦).如下图所示,在没有光线的情况下,Cas9被吖啶a4束缚,变为非活性状态。在蓝光的存在下,acria4被LOV的展开所抑制,允许Cas9的释放。

不值得注意的Casanova系统的应用是它的使用光介导CRISPR标记研究染色质结构(霍夫曼等,2020)。荧光DCAS9蛋白可用于鉴定用于成像技术的特定基因组基因座。由于DCAS9的表达可以潜在地改变基因组和染色质架构,因此调节发生DCAS9结合的时间是有用的。Bubeck等人。在U2OS细胞中表达了一种端粒靶向GRNA和具有三个红色荧光标签的DCAS9融合蛋白。在光激活后,DCAS9在分钟内释放,在后面的20-40分钟内形成的红色焦点。Casanova系统是通用的,因为它可以适用于调节基因编辑,打开转录,标签染色质和研究动力学。

光激活的抗crispr蛋白在蓝光下变得活跃

利用化学技术对crispr进行photocage

前面提到的技术都采用了一种光活性策略从自然产生的光活性蛋白(即CRY2和Vivid)中设计而成——另一方面,Alexander deiter的实验室采用了不同的方法。这些研究人员使用了一种基因编码photocaging技术插入可轻默的保护组,特别是a硝基苯基光固化赖氨酸(PCK),在Cas9蛋白上Hemphill等人,2015).为了将PCK插入到Cas9上的特定位置,小组使用了一个工程吡咯基tRNA/tRNA合成酶对它将在到达琥珀色终止密码子标记时添加PCK。(使用Pyrrolysl TRNA合成酶来了解有关特异性特异性氨基酸的特异性掺入,读这篇文章).

研究小组首先对Cas9中的各种赖氨酸进行了光固化,以确定哪一种能最好地抑制蛋白质切割目标DNA的能力,然后对K866赖氨酸进行光固化,如下图所示.接下来,Hemphill等人利用双报告荧光实验证明,Cas9 K866PCK突变体在紫外光(365nm)照射前确实是不活跃的,在紫外光照射后,它显示出与野生型Cas9相似的切割活性。当使用光掩膜技术时,这种光捕获技术也可以对Cas9的裂解进行空间控制。最后,Hemphill等人提出的数据表明,这种基因编码的、感光的Cas9系统可以沉默内源性基因表达——表明光诱导HeLa细胞中转铁蛋白受体CD71的沉默。

光盘化学品从Cas9释放,用UV光。然后Cas9变得活跃

光激活CRISPR策略的比较

出版 系统绰号 可光激活部分 Cas9 Variatn. CRISPR蛋白质应用
分裂系统/光诱导二聚
nihongaki等。,2015年 Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
Polstein等人,2015 蕾丝 Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
nihongaki等。,2015年 Pacas9. 来自N. Crassa的磁蛋白 拆分CAS9,拆分CAS9 Nickase,分开DCAS9 NHEJ和HDR的基因组编辑,CRISPRi的基因表达抑制
nihongaki等。,2017年 Split-CPTS2.0 Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 基因转录的激活
Kim等人。,2019年 Ladl. Cry2和A来自A. Thaliana的Cib1 DCAS9. 激活基因转录。标签基因组基因座。改变染色质架构。
yu等,2020年 来自R. sphaeroides的bph 分裂Cas9 基因组编辑NHEJ和HDR。可以用于体内模型吗
单链Photoswitchable Cas9
Richter等人。,2016年 tsRC9 RsLOV来自R. sphaeroides Cas9, dCas9 基因编辑
周等人。,2018年 pdDronpa Cas9, dCas9 编辑、基因转录
依赖光Anti-CRISPR
Bubeck等人,2018年 卡萨诺瓦 来自A. Sativa的Lov2 Acria4抗CRISPR蛋白,与CAS9或DCAS9共同表达 基因编辑和转录的抑制。标签基因位点
光化学控制
Hemphill等人。,2015年 Nitrobenzyl-caged赖氨酸 Cas9 K866PCK突变 基因组编辑NHEJ和HDR
Jain等人。,2016年 Crispr-Plus. 机油包裹ssDNA寡核苷酸 Cas9, photocaged-gRNA 基因编辑
《Manna》等,2019年 NPPoc-Conged Trimethokim(TMP) Cas9与失稳区域融合(Cas9- dhfr) 编辑、基因转录
周等人。,2020年 NPOM笼核碱基 Cas9, photocaged-gRNA 基因编辑

有关详细信息,请查看此信息比较光基因CRISPR技术的综合综述(Matony等,2020)。无论您是否正在寻求激活,压制或修改基因,您现在可以使用您使用的工具来控制使用光的基因组编辑。我们期待更多的工具作为CRISPR和Optogenetics继续发展,迫不及待地想看到您将来使用这些的很酷的应用程序!


参考

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额外的资源

  • “Optimetics通过JEF AKST迎接杂志科学家
  • “photactivatable#crisp-cas9系统!”由Doug Mortlock onCRISPR博客

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