克服熊病毒生产的挑战

由梅根·“政府改造”

生产慢病毒

慢病毒载体伟德BV下载是流行的基因传递工具,生产慢病毒,可以构成某些挑战。是否选择一个最适合实验的系统,试图产生可用的病毒效价,或者对目标细胞系的选择和表达进行微调,研究人员往往发现自己面临着障碍。在这篇文章中,我们将概述与产生和使用慢病毒相关的一些常见挑战,并提供一些克服这些障碍的技巧和技巧。

谈论我这一代(慢病毒一代)

通过Lentivirus递送基因的第一步是决定特定实验最适合的包装系统。较新一代的慢病毒包装系统旨在防止复制竞争力的慢病毒(RCL)。复制能力可能来自病毒生产过程中的重组事件,对用户带来生物安全风险。为了降低此类事件的风险,新的慢病毒包装系统将病毒元素分为多个质粒。第二代包装系统使用3质粒;通常编码VSV-G的包膜质粒,含有含有结构基因的包装质粒和携带转移基因的转移质粒。通过将病毒元素除以多种质粒,重组的风险和因此,大大减少了RCL的产生。第三代包装系统通过从包装质粒中除去病毒Rev基因并将其掺入第四质粒来进一步分割病毒基因组。另外,5'长末端重复(LTR)的启动子在第三代系统中突变,使得它不再需要病毒反辐期剂TAT。有关不同几代慢病毒包装系统的更多信息,请参阅addgene's慢动力指南

虽然第三代包装系统提供了一个额外的安全水平,他们也需要第四个质粒。对额外DNA的需求会影响包装细胞系的转染效率,从而影响病毒的滴度。额外的质粒也会影响实验的优化。在开始实验之前,建议您尝试几种不同的转移、包膜和包装质粒的比率,以获得最佳滴度。需要额外的质粒转染可以使这些优化实验更具挑战性。考虑到这些因素,当计划一个实验时,使用者应该权衡提高生物安全性的好处与潜在的打击滴度;在选择正确的系统时,应考虑最终用户的BL2经验水平、转基因的规模以及下游应用。

第2和第3代慢病毒质粒

最近,A.第四代封装系统已通过Clontech提供。该系统通过将病毒基因组分裂为其他质粒,从而增加产生RCL所需的重组事件的数量,从而提高安全性。为了克服第三代包装系统的滴度障碍,该系统整合了Tet-off转录激活系统,以驱动某些病毒成分的高水平表达;根据制造商的说法,这些变化导致产量高达25倍比其他可用系统。

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生产Lentivirus:这是关于T的​​(转染和滴度)

PEI转染比率对效率的影响为了生产慢病毒,将编码结构元素,包膜和转移基因的质粒转染到包装细胞系中,通常是293t的衍生物。将包装细胞孵育,在几天后,收集上清液,过滤并滴定。获得可用的慢病毒的主要障碍是为您的实验产生足够高的浓度或滴度。改善滴度,首先优化转染条件。如上所述,可以调节质粒比以增强滴度。此外,转染方法(即聚乙基亚胺,磷酸钙或脂质体方法),反应的体积,以及收获的时序和数量都会影响滴度。重要的是,一个转移质粒的优化条件并不总是最适合他人。例如,在我们手中,我们发现48和72h的双重收获方法产生高滴度病毒,用于用小插入物(如CRISPR导向器)转移质粒(例如CRISPR导向器),而单个72h收获是最适合Cas9的较大基因。有关转染比率如何影响转染效率的示例,请参见图1。

对于一些转基因,转染优化并不足以获得足够的效价;这种情况经常发生在大基因上。这是由于大型插入的封装效率低下;一项研究Kumar等人发现,在某些情况下,插入大小每增加2kb滴度就会下降10倍。为了克服这一问题,可以采用各种方法对慢病毒进行浓缩,如超离心法、离心分离法等蔗糖梯度,旋转柱,聚乙二醇(PEG)沉淀。所有这些方法最终都能分离出病毒颗粒,让你可以集中在更小的体积里。因此,你将得到一个相当低的体积比未浓缩的准备。例如,在Addgene,我们通常集中100倍,即10厘米2与从未浓缩的制剂中收集的15毫升相比,培养皿制备的病毒只能得到150 μl的物质。

考虑到这一点,如果实验需要一定量的病毒,请考虑通过增加10厘米的数量来缩放2菜肴或增加血管尺寸。选择更大的容器,例如3或5层瓶将需要一些初始优化;在开始之前,需要优化细胞数,介质体积和质粒浓度。我们建议计算较大容器的表面积与10厘米的比率2培养皿并据此调整细胞数量、质粒浓度和实验体积。虽然您可能需要做一些最后的调整,但这通常是一个很好的开始。如果您没有预料到常规上将需要大量的慢病毒,您可以选择简单地增加10厘米的数量2菜肴。虽然这个选项很有吸引力,因为单个10厘米的过程相同2盘子可以很容易地应用到多个盘子,记住处理多个盘子将花费更长的时间,并可能增加错误或污染的风险。

最后,浓缩方法的选择取决于各种因素,例如可用资源,成本和下游应用。例如,虽然PEG沉淀方法相对便宜并且不需要超速纤维,但PEG将在溶液中沉淀所有蛋白质,而不仅仅是慢病毒;因此,当下游需要纯病毒时,这可能不是最好的方法。

在评估慢病毒滴度时,不要拿苹果和橙子做比较

在选择包装系统和生产慢病毒后,是时候滴度。当测定慢病毒滴度时,一个重要的考虑因素是用于滴度的细胞系。通常,研究人员会选择一个相对宽松的细胞系进行滴度,以获得最佳滴度。虽然这一信息提供了一个很好的起点,但它可能无法转化为目标细胞系。为了克服这个问题,我们建议在转导靶细胞系时使用一系列剂量的慢病毒。人们还应该考虑滴度转导实验的细节。培养基选择、反应容器、病毒剂量、体积和转导时间都将影响所记录的效价,在转导靶细胞系时应予以考虑。有关慢病毒滴度的更多提示,请参阅我们的博客

在选择最佳的慢病毒系统、产生可接受滴度的病毒和成功转导感兴趣的细胞系之间,很多事情都可能出错。我们希望我们已经为您提供了一些想法,如果您遇到了障碍,可以考虑并鼓励您检查慢病毒协议博客文章Addgene网站获取更多资源。


参考文献

关键词:慢病毒载体;包装极限;伟德BV下载胡志明。2001年10月12日。北京:北京大学出版社。PubMed.PMID: 11589831

江W.等。Al ..一种优化的高滴度慢病毒制剂的方法,无需超速离心。SCI REP。2015;5:13875。PubMed.PMID:26348152.。公共医学中心PMCID: PMC4562269

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