PCXLE Toolkit:高效的基于重组质粒的方法,用于将外周血细胞重新编程为IPSCS

由Guest Blogger.

这篇帖子由Kusumika(Kushi)Mukherjee是Massachussetts综合医院的博士后贡献的。

PCXLE Toolkit是一种基于重组的基于重组的血细胞,用于将外周血细胞重新编程为IPSCS

几十多年来一点回来yamanaka.并且同事报告说,可以通过添加将分化细胞重新编程为诱导多能干细胞(IPSC)重新编程(或“Yamanaka”)因素,他们改变了再生医学的景观。他们的工作为IPSCS的临床和治疗应用开辟了巨大的可能性。人体IPSC(HIPSCS)的生成现在提供了开发和使用别难以获得的患者特异性体细胞的机会。然后可以用于进行细胞疗法和模型疾病体外

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已经探讨了许多成人体细胞来源的IPSC编程在从成纤维细胞和角质形成细胞到外周血单核细胞(PBMC)的适用性。从整个血液中分离的PBMC为IPSC的生产带来了许多好处:

  1. 与收集成纤维细胞的过程,容易且常规地从患者中携带血液,这是收集成纤维细胞的过程,这需要更具侵入性皮肤活组织检查程序。这成为招募患者,特别是儿童和皮肤病患者进行研究和临床试验时成为一个重大好处,因为它允许获得更多愿意的参与者。
  2. 虽然从老年患者获得的成纤维细胞重新编程较低,但在获得血液的患者的年龄之间没有发现这种相关性,并且随后的重编程成功[1]。
  3. 需要培养和扩展成纤维细胞体外进行几次传代,以产生足够数量的起始细胞用于重编程,而从血液中收集的pbmc在收集后立即被重编程[2]。
  4. 与年龄匹配的成纤维细胞相比,PBMCs显示出更接近hiPSCs的独特表观遗传特征[3.]。

这些优势使PBMCS用于重编程目的的体细胞的理想来源。在这篇文章中,我将描述一种重组载体系统,通过对P53的ShRNA的表达,改性的重编程因子鸡尾酒和病毒蛋白EBNA-1来提高重编程效率。

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从PBMCS重编程HIPSCS的方法

虽然重新编程的选择方法通常取决于体细胞的来源,但所有重编程方法的共同目标是重新编程因子-OTE13 / 4,SOX2,KLF4和C-MYC [1]的表达。对于临床级HIPSC的衍生,优选通过整合病毒载体来改变原始基因组的重编程方法是优选的。伟德BV下载这是为了避免插入诱变的可能性,这是转基因进入基因组的基因组,这可能导致插入位点中的功能基因的破坏,并且可以潜在地促进肿瘤发生体内。现象已在过去的基因治疗试验中记录,并且仍然是临床领域的安全问题[4.]。在为临床目的生成HIPSC时,考虑了三种主要的重编程方法:

  1. mRNA转染-这允许重编程因子的瞬时表达
  2. 仙台病毒 - 一种非整合RNA病毒
  3. Episomal载体-表达重编程因子的染色体外DNA质粒

迄今为止,MRNA转染方法尚未成功使用,从PBMCS获得IPSC。大多数实验室使用仙台病毒有效地重新编制PBMC [5.]。然而,仙台病毒的方法是昂贵的,特别是如果用于制造临床级hiPSCs。例如,Cytotune™-IPS 2.1仙台重新编程套件旨在产生临床等级HIPSCS在Thermofisher Scientific的11,000美元上销售,可用于6-8个重新编程反应。使用仙台病毒的另一个缺点是残留病毒材料的持久性[6.]。完全除去残留病毒颗粒和无病毒HIPSC的建立通常需要约5-10个通道。此外,与仙台病毒合作需要严格的生物安全措施,从而提高程序的成本。重组重新编程是一种创建临床级,安全,非血管和不孤化髋关节的理想和成本效益的方法,其中编码重编程因子的载体表现为靶细胞核中的单独的颗粒状致素元素。该方法还降低了仙台病毒的生产和用途涉及的生物安全问题。

具有重组载体的PBMC的重新编程效率

Episomal载体基于Epstein-Barr核抗原-1 (OriP -EBNA-1)系统,每个载体包含一个DNA复制的病毒起源,OriP和编码DNA结合蛋白EBNA-1的EBNA-1序列[7.]。这两个序列是必要的,并且足以用于人体细胞中载体的保留和复制[8.]。EBNA-1蛋白可以识别OriP,并在宿主细胞中诱导与DNA扩增同时发生的偶染色体扩增。这使得相对高和长期表达的重编程因素。然而,episomal载体对PBMCs重编程产生hiPSCs的效率很低(0.001-0.03%)[3,9.]。2011年,Chou等人。产生两个编码六个因素的载体的混合物 -10月3日SOX2.KLF4c-myc.Lin28.和SV40大T抗原(SV40LT)。当使用PBMC作为体细胞来源时,该方法的重编程效率仅为0.001%。这在最佳情况下,这仅转化为每100毫升开始血液样本的16个HIPSC菌落[7]。在患者血液样本有限的临床环境中,这种低编程效率是使用PBMC作为用于重编程的体细胞来源的主要障碍。

提高PBMC重编程效率:pCXLE episomal vector工具包

它已被证明,TP53的抑制增强了替换的IPSC生成c-myc.L-MYC[10.11.]。虽然在存在这两个因素的存在下,潜在的IPSC生成的机制尚不完全理解,但添加了P53并更换了shRNAc-myc.L-MYC在okita等人的重组重编程鸡尾酒中。增加了PBMCS中的重编程效率[7]。由本组产生的PCXLE简谱载体系统是编码重编程因子的三种重组质粒的优化混合物。通过电穿孔将重组载体引入细胞中。电穿孔后10天获得HIPSC菌落,其中大部分是无一性的,核型正常,并且能够区分为所有三种胚层的各种细胞类型[7]。

为了进一步提高重编程效率,额外的质粒,PCXWB-EBNA-1用于重编程鸡尾酒。PCXWB-EBNA-1缺乏orip,无法在人体细胞中复制,从而瞬时表达额外的EBNA-1。瞬时表达的EBNA-1增加了来自其他再生质粒的蛋白质表达。在PBMC上使用时,PCXLE eBisomal载体系统将重新编程的效率从0.001%增加到近0.1%[7]。就HIPSC菌落而言,现在可以从仅1毫升的外周血获得近16个HIPSC菌落,从先前报道的努力中获得了巨大的改善。因此,PCXLE eBISomal系统提供了一种从易于接近的患者血样产生无转基因的无病毒临床等级HIPSC的实用方法。addgene提供表1中列出的所有PCXLE矢量。

表1:PCXLE卵泡质粒的列表,他们的addgene身份证号码和它们编码的重新编程因子

重组质粒 Addgene ID # 编码
PCXLE-HSK. 27078 SOX2和KLF4.
pCXLE-hUL 27080 L-MYC和LIN28
PCXLE-HOCT3 / 4-SHP53-F. 27077 Oct3 / 4和ShRNA对抗P53
pCXWB-EBNA1 37624 瞬态EBNA-1


非常感谢我们的客座博主Kusumika (Kushi) Mukherjee。

李继续追查照片Square.pngKusumika(Kushi)Mukherjee目前是马萨诸塞州普通医院的博士后研究员,在基因编辑和干细胞领域进行了研究兴趣。与她联系在linkedin @上https://www.linkedin.com/in/kmukherjeephd /

参考文献

1.El Hokayem, Jimmy, Holly N. Cukier,和Derek M. Dykxhoorn。血液诱导多能干细胞(iPSCs):益处、挑战和未来之路阿尔茨海默病和帕金森病杂志6.5(2016)。PubMed.PMID: 27882265。pmed中央PMCID:PMC5118044.

2. Kim,Y.等人,从血细胞产生人诱导的多能干细胞:通过离心使用重编程细胞的连续电镀的有效方案。干细胞int,2016。2016年: p。1329459。PubMed.PMID: 27579041。pmed中央PMCID:PMC4989082

3.通过非整合质粒从具有独特的表观遗传和基因表达特征的血细胞中获得高效的iPS细胞。细胞Res, 2011。21.(3): 518 - 29页。PubMed.PMID:21243013。pmed中央PMCID:PMC3193421.

4. Hacein-Bey-Abina,S.等,Al。,LMO2相关克隆T细胞在SCID-X1基因治疗后两名患者中的增殖。科学,2003年。302(5644):p。415-9。PubMed.PMID:14564000.

5.Seki, T., S. Yuasa和K. Fukuda,使用活化的T细胞和仙台病毒结合,从少量的人外周血中诱导产生多能干细胞。Nat Protoc, 2012年。7.(4):p。718-28。PubMed.PMID:22422317

6. Diecke,S.等人,近期技术更新和诱导多能干细胞的临床应用。韩国J实习生,2014年。29.(5):p。547-57。PubMed.PMID:25228828

7. okita,K。等,是一种有效的非血管方法,从脐带血和外周血细胞产生无酰上的人诱导的多能干细胞。干细胞,2013年。31.(3): 458 - 66页。PubMed.PMID: 23193063

8.Ehrhardt等,Episomal载体用于基因治疗。柯尔·吉恩·瑟,2008。8.(3):p。147-61。PubMed.PMID: 18537590

9. Mack,A.A.等人,从CD34 +细胞产生诱导的多能干细胞,其血液从多种供体吸收的血液中,具有非整合的再生体载体。Plos一个,2011年。6.(11):p。E27956。PubMed.PMID:22132178。pmed中央PMCID:PMC3222670

10. HONG,H.等人,P53-P21途径抑制诱导多能干细胞产生。自然,2009年。460(7259):p。1132-5。PubMed.PMID: 19668191。pmed中央PMCID: PMC2917235

11. Nakagawa,M.等人,促进转型缺陷Myc直接重新编程。突破Natl Acad Sci U S,2010。107(32):p。14152-7。PubMed.PMID:20660764。pmed中央PMCID:PMC2922531.

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