质粒101:复制的起源

由肯德尔摩根

最初发布于2014年2月6日,最后更新了11月10日,2020年11月10日。

现在我们都知道了抗生素抗性基因,让我们考虑另一个任何质粒的基本元素:Replication / Replicon的起源。复制子由复制的起源组成(ori)和所有控制元素。这ori是DNA复制开始的地方,使质粒能够再现,因为它必须在细胞内存活。

质粒的复制子通常不同于那些用来复制宿主染色体DNA的复制子,但它们仍然依赖于宿主机制来制造额外的复制。ori序列通常高于和Ts。你为什么问?嗯,A-T碱基对与两个氢键保持在一起,而不是G-C对。结果,富含A-T对的DNA的延伸可以在较低的温度下更容易地分离,并允许复制机械室进入并忙于制作副本。

复制起源的类型

在那里有很多复制起源,因此,为了简单起见,我们忽略了真核细胞和病毒中使用的那些,并且仅关注细菌中的那些。您可能看到的一些常见包括COLE1,PMB1(以稍微不同但众所周知的衍生物),PSC101,R6K和15A。并非所有复制的起源都是平等的。有些人会产生许多质粒副本,其他质粒副本只需几份副本,这取决于它们的监管方式。通常,复制的控制被称为“放松”或“严格的这取决于是否ori分别受到RNA或蛋白质的正调控。质粒的拷贝数与正调控和负调控之间的平衡有关,可以通过复制子的突变来操纵。例如,pMB1ori每个单元维护大约20个副本,而pUC-这仅不同的两个突变-每个单元格将产生多达700份。

质粒图显示了可选择的标记和抗生素抗性基因,以及ori、启动子和插入基因周围的多克隆位点
图1:质粒图显示质粒的标准特征。

那么,你该如何选择呢?Addgene高级科学家玛西·帕特里克表示,研究人员可以先问自己几个问题:

  • 质粒是否只用于大肠杆菌?一般革兰阴性细菌?克果实和克玉米袋?
  • 您是否一次只在您的细胞中键入一个质粒型?
  • 你想制造很多质粒吗?
  • 基因是否有大量毒性?它总是好的kEEP记住,低至中等拷贝数的质粒仍然可以表达赋予适当的大量蛋白质启动子和生长条件。

明智地选择您的复制起源,避免质粒不相容

换句话说,最好的选择ori取决于您想要维护多少个质粒副本,您打算使用的主机或托管,以及您是否需要考虑血浆与一种或多种其他质粒的相容性。一般来说,质粒具有相同的ori不相容因为他们将竞争相同的机器,创造一个不稳定和不可预测的环境。通常,来自同一组的质粒不应转化,所以如果你需要两个质粒进行实验,请确保它们“兼容”ori's。有关更多详细信息,请参阅下表。

共同的载体 拷贝数+ ori 不相容组 控制
PUC. 〜500-700. PMB1(衍生物) 一种 轻松
PBR322 〜15-20 PMB1. 一种 轻松
宠物 〜15-20 PBR322 一种 轻松
PGEX. 〜15-20 PBR322 一种 轻松
Pcole1. 〜15-20 COLE1. 一种 轻松
PR6K. 〜15-20 R6K * C 严格
pACYC 〜10 P15A. B. 轻松
PSC101. ~ 5 PSC101. C 严格
pbluescript. 〜300-500. ColE1(导数)和F1** 一种 轻松
PGEM. 〜300-500. 举办F1和* * 一种 轻松

这个表定义了常见的克隆向量、它们的拷贝数、ori和不相容组。请注意,A -C配伍分组是一个任意的名称,来自同一不配伍组的质粒不应该共转化。

+实际拷贝数因而改变。请参阅下面以获取其他注意事项。

*需要PIR基因进行复制(参考)。

**F1是噬菌体衍生的ori这允许将SSDNA的复制和包装成噬菌体颗粒。具有噬菌体衍生的质粒ori'S.被称为phagemids

影响质粒拷贝数的其他因素

虽然顺序和调节ori显着影响质粒的拷贝数,其他外部因素也有贡献。如果您计划净化您的质粒DNA,这些考虑因素特别有用:

插入物

  • 如果细菌含有大的插入物或产生有毒产物的基因,它们倾向于保持较少的质粒拷贝。

大肠杆菌应变

  • 大多数大肠杆菌菌株可以用来传播质粒,但endA大肠杆菌是最好的高产质粒。

生长条件

  • 曝气量、温度、培养量、抗生素和培养基都能影响拷贝数。一些ori温度敏感;其他ori可以“欺骗”扩增更多拷贝,加入氯霉素-确保你的成长条件没有对你不利!

文化培养液

  • 新条纹的细菌有更高的拷贝数-最佳结果总是挑选一个殖民地,不要从甘油股,琼脂刺伤或液体培养中脱培养。
  • 新转化的细胞还给出了从甘油原料中划线的菌落的更高质粒产率。
  • 孵育12-16小时倾向于给予更高的拷贝数,因为细菌刚刚达到固定阶段,但细胞尚未开始死亡。


有什么问题吗?需要澄清吗?如果有的话,请在评论中发表。此外,如果您对未来的质粒101系列主题有任何特殊要求,请让我们知道,并继续关注下一期。

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