作为分子生物学工具的细菌毒素-抗毒素系统

由詹妮云顶娱乐 韦德国际弗曾

细菌世界的成员生产各种各样的毒素来占领领土或杀死竞争的微生物,但你知道细菌也会产生对自己有毒的物质吗?

什么是毒素-抗毒素系统?

这些有毒物质是广泛存在于细菌中的毒素-抗毒素系统的一部分。它们由一种可以影响多种细胞过程的毒素和一种抑制毒素活性的抗毒素组成。这些系统的关键是,毒素是稳定的,而抗毒素是不稳定的,这意味着细胞必须不断产生抗毒素,以避免细胞死亡。

在质粒的情况下,毒素-抗毒素系统作为“自私的”DNA片段,其唯一目的是确保自身及其相关基因的繁殖。这些系统更好地确保质粒代代相传(图1)。这些所谓的“质粒依赖系统”需要细胞分裂来保留质粒——如果一个细胞由于质粒分配不恰当而没有继承质粒,它仍然会继承一些毒素和抗毒素。然而,抗毒素会被降解,使细胞被更稳定的毒素杀死。只有保留了质粒的细胞才能存活。

质粒成瘾系统概述质粒成瘾系统自被发现以来,已被广泛应用于分子生物学或生物学领域在活的有机体内研究。让我们来看看许多类型的质粒成瘾系统及其应用。

毒素-抗毒素系统的发现

毒素-抗毒素系统最早是在1983年,小仓照和平贺彰田结果发现,如果一个mini-F质粒携带了特定的700bp DNA片段,则质粒的增殖效果优于没有该DNA片段的质粒。

他们最终将这块碎片命名为ccdB地区(“coupledcl形的division”)。编码的毒素-抗毒素系统由CcdB(毒素)和CcdA(抗毒素)组成,CcdB通过结合DNA旋回酶的GyrA亚基并将其捕获到裂解复合体中来推测DNA复制。这会导致DNA断裂和细胞死亡。相反,CcdA与CcdB结合并阻断其活动。

的应用ccdB在质粒克隆

也许CcdB应用最广泛的是网关TM克隆,那里的ccdB基因作为一种反选择标记在目标向量中。成功克隆发生时ccdB基因被兴趣基因所取代。结果,保留ccdB基因的细胞死亡,而含有ccdB基因的转化子的比例更高ccdB表示“不”结构。

其它毒素-抗毒素系统及其应用

迷宫/ MazF

除CcdB/CcdA外,还有许多蛋白质类的毒素-抗毒素系统。最著名的蛋白质毒素-抗毒素系统之一是迷宫/ MazF。MazF毒素是一种核糖核酸酶,它能切割RNA中的特定序列,从而导致蛋白质合成的阻塞。抗毒素迷宫结合和抑制MazF,不断地被ClpAP蛋白酶裂解,因此在没有持续产生迷宫的情况下,毒素就会变得活跃。

沈洋的实验室利用mazF作为一个反选择的标记来创建酵母中未标记的基因修饰毕赤酵母属pastoris。通过在一个质粒中结合阳性选择和反选择,他们能够创造一个有效的克隆工具。的质粒pKSCTMF包含了mazF该MazF-ZeoR盒两侧有两个直接重复序列,可以用于去除标记,以便标记可以重复使用,在同一菌株中引入多个遗传修饰。MazF表达式受AOX控制1甲醇诱导表达的启动子。一旦线性化,递送载体可以整合到基因组中,通过选择Zeocin抗性引入包含在其中的遗传修饰。然后,用甲醇培养基进行反选择,选择那些通过两次侧翼重复之间的第二次重组事件而去掉了盒式磁带的细胞。在没有重组发生的细胞中,甲醇诱导有毒MazF的产生,导致细胞死亡。研究小组用这个盒子敲除基因,敲入一个GFP盒子,并引入位点定向突变,所有这些都没有引入不必要的选择标记。

MazF质粒上瘾

限制修改系统

由于限制性修饰系统由两种具有相反活性的酶组成,因此它们也发挥毒素抗毒素作用也就不足为奇了。限制性内切酶和甲基转移酶组成限制性内切酶修饰系统。限制性内切酶在特定的核苷酸序列处或附近切割DNA。为了应对这种情况,甲基转移酶将甲基添加到特定核苷酸序列的碱基上,防止同源限制性内切酶切割DNA。限制性内切酶在质粒添加中的作用是由的研究EcoRIBsp6I大肠杆菌在1995年,当对质粒引入限制性修饰系统时,与没有限制性修饰系统的质粒相比,细胞群体保留了更多的这些质粒。

与上面描述的其他毒素-抗毒素系统一样,这两个系统中的一个比另一个更稳定。这里,限制性内切酶比甲基转移酶更稳定。当质粒丢失时,甲基转移酶随着细胞的生长而降解和/或稀释,导致染色体上出现未甲基化位点。更稳定的内切酶可以切断染色体导致细胞死亡。

反义RNA-regulated系统

毒素-抗毒素系统不仅仅局限于蛋白质领域。让我们来看看一个由反义RNA调控的毒素-抗毒素系统,它的碱基对与mRNA同源并抑制其翻译。

hok / sok系统是第一个被发现的反义rna调控的毒素-抗毒素系统。与刚才描述的系统不同,hok/sok系统由三个部分组成:

  1. 主机杀死(hok),一种破坏细胞膜的长寿毒素;
  2. 制止捕杀(目前)是一种短命的RNA抗毒素;
  3. 杀戮的调制(mok),需要hok翻译。

这里,Mok和Hok的翻译是耦合的。从Shine-Dalgarno (SD)序列翻译mok导致Mok和Hok的翻译,触发细胞死亡。然而,目前反义rna结合下游的序列mokSD导致双链RNA结构被RNaseIII识别和剪切,从而导致细胞存活。

莫学松毒素抗毒素系统

质粒依赖系统可以是用于驱动高蛋白表达的结构的伟大补充在活的有机体内。如果没有质粒依赖系统,表达质粒常常丢失。例如,Cara Morin和James Kaper使用hok/sok系统创造能稳定表达抗原的菌株足够的量产生免疫反应。作为概念的证明,他们测试了一个勒克斯介导的生物荧光记者在活的有机体内在没有选择压力的情况下,发现质粒在5天后保持100%的稳定性。

杰夫·海斯蒂和桑吉塔·n·巴蒂亚也使用了hok/sok毒素-抗毒素系统构建稳定的合成基因电路可以长期使用。使用一个携带hok/sok毒素-抗毒素系统的质粒他们能够在48小时内监测lacZ的活动在体外没有抗生素的选择。在一个皮下肿瘤模型中,研究人员发现,24小时后,不到10%的细胞保留了不稳定的质粒,而含有质粒成瘾系统的质粒保留了75%的细胞。他们能够将该系统应用于口服诊断,通过在尿液中产生可检测信号来指示肝转移的存在。

质粒成瘾系统的底线

虽然这些系统本质上是自私的,但当质粒保留没有选择压力或长期实验需要时,这些系统已经被研究人员用于许多用途。他们还帮助研究人员设计和优化利用反选择的克隆方法。自从他们的发现,质粒成瘾系统已经成为一个强大的工具,以解决各种各样的生物学研究。

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参考文献

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