质粒的PCR克隆

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在最简单的形式中,基于PCR的克隆就是复制一个DNA片段,同时在该DNA片段的末端添加限制性内切位点,这样就可以很容易地将其克隆到感兴趣的质粒中。您可以使用类似的过程为感兴趣的插入添加外挂吉布森组装。引物设计的步骤和PCR过程本身非常类似于在我们的概述限制克隆后对于PCR克隆过程的几个QUIRKS - 如果您需要更详细的下游步骤,请查看该帖子。

在本例中,我们将描述如何将一个cDNA从一个载体复制到一个更适合分析该基因功能的新载体中。如下图所示,我们将EcoRI和NotI位点添加到您的兴趣基因(YGOI)中,以便连接到受体质粒。

使用PCR质粒克隆的示意图。所示的步骤包括首先通过PCR扩增感兴趣的片段并消化它。然后将其连接到剪切矢量骨架中。

基于PCR的克隆设计引物

用于分子克隆的基本PCR引物包括:

  • 领导序列:在引物的5'末端额外的基对有辅助酶消化(通常为3-6bp)

  • 限制站点:你选择的克隆限制位点(通常6-8bp)

  • 杂交序列:与待扩增的序列结合的引物的区域(通常为18-21bp)

在选择酶切位点时,应该使用DNA分析工具,例如Addgene的序列分析仪,允许您识别给定序列中存在哪些限制站点。您想选择以下内容:

  • 不要在插入内切割

  • 处于受体质粒中的所需位置(通常在多克隆部位(MCS)中),但不会在质粒上的其他地方切割

  • 奖金:选择可以在同一缓冲区中函数的限制酶有助于,因为这将稍后节省时间

在我们的示例中,我们将使用Ecori和Noti将我们的cDNA连接到受体质粒中。记得通过观察MCS并将上游限制部位融合到正向引物和下游限制部位,将DNA以正确的取向插入受体质粒中的正确取向。

接下来,我们需要检查我们想要放大和设计绑定并复制它的引物的DNA序列。以下图像显示ORF的末端以及这些末端用于引物设计:

使用具有延伸的引物的PCR克隆

因为我们正在克隆一个ORF,所以我们想从起始密码子(ATG)克隆到终止密码子(TGA,在这个例子中)。假设你是从质粒DNA(而不是从基因组DNA或cDNA文库)进行扩增,大约18-21bp通常足以提供特异性,并与标准PCR反应兼容(见PCR视频)。因此,我们的正向引物将使用序列5'-ATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'用于与ORF结合的区域,我们将在该引物的5'端添加EcoRI酶切位点(GAATTC),使我们的正向引物5'-GAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3'。

许多限制性酶在线性件的末端没有有效地切割DNA(参见的更多信息)。因此,我们建议您在限制点上游添加3-6个碱基,以提高切割效率。你通常可以添加任何6个碱基,但你应该确保碱基不会导致形成一个发夹结构在你的底漆。在本例中,我们将添加TAAGCA,得到5′-TAAGCAGAATTCATGTGGCATATCTCGAAGTAC-3′的最终正向引物序列。

对于反向引物,设计类似,但我们需要使用反向补充来获得PCR扩增。我们可以同样地开始,采用最终的ORF基地,包括止挡密码子(5'-TGGCatattcGaAgTactGA-3'),然后添加Noti(Gcggccgc),然后添加Taagca以改善限制酶消化。这为我们提供了一系列5'-TGGCATTATCGAAGTACTGAGCGCGCCGCCA-3'(30BP,与ORF有18BP的同源性)。我们现在需要生成这个序列的反向补充,以便我们可以成功放大ORF。您可以使用现有软件生成反向补充(快速互联网搜索将导致您在这里还有许多人)。如果我们将序列放入该计算器中,我们选择了我们的反向底漆(5'-TggcatatattcgaAgtactGagcGCGCGCTAAGCA-3'),我们得到了5'-TGCTTAGCGCGCGCTCAGTCGAGATGCCA-3'的最终反向引物序列。

制备用于克隆的PCR产物

近距离观察限制消化克隆。两个DNA片段被消化,然后连接在一起

进行PCR反应

运行PCR以扩增您的插入DNA。使用高保真聚合酶非常重要,以最小化突变。聚合酶的保真度变得更加重要,即预期的PCR产物越长。您应该基于引物的部分的熔化温度(Tm)选择退火温度,其与待扩增的序列杂交(在这种情况下的ORF),而不是整个引物的Tm。如果您从质粒或简单模板中放大,则误解的机会很少,因此您可以使用非常广泛的退火温度,但如果您尝试,您可能需要增加底漆长度并增加TM从基因组DNA,cDNA文库或通过RT-PCR克隆。

PCR产物分离

使用试剂盒将PCR产物与其余的PCR反应分离,例如Qiaquick PCR纯化套件。PCR产物现在可以进行酶切了。因此,此过程中后面的步骤与我们在限制克隆后。然而,甚至超过标准限制克隆,你就是必不可少的验证你最终的质粒通过Sanger测序。用PCR进行DNA复制的错误率从大约每500bp 1到大约每1000万bp 1不等,这取决于所用的聚合酶。无论你使用哪种聚合酶,对最终产物进行测序都是很重要的。


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话题:质粒克隆聚合酶链反应质粒

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