质粒制剂:不同纯度,不同数量,不同用途

由保罗Colombi

保罗Colombi

并不是所有的质粒都是一样的。在从细菌培养物中纯化质粒之前,考虑你的实验是很重要的。它将决定你需要的DNA数量,以及纯度的水平。基于这些前提,我们可以将质粒制备分为三种不同的方式:

  • DNA转换级
  • DNA克隆等级
  • DNA转染级别
转换
图1:转化将转化级质粒引入细菌细胞。

DNA转换级

转换是将外源DNA插入微生物中的过程。质粒DNA的数量是必要的细菌转化的化学和电活性细胞是最小的(皮克范围)。它可以从小型细菌培养物(即2-3毫升)中提取,有或没有商业上可用的试剂盒,用于转化的DNA不需要像其他用途那样纯净。

DNA克隆等级

分子克隆包括一组技术,用于将重组DNA从原核生物或真核生物插入可具有质粒或病毒来源的合成载体中。这克隆方法的类型您最终选择会影响所需的DNA的数量,因此,也决定了您将采用的细菌培养和商业套件的所需尺寸。限制性内切酶基于方法可能需要几百纳克或微克的起始材料;吉布森组装或者金门组装使用更直接的方法,允许科学家从更少的DNA (ng范围)克隆。

为了实现高效和无瑕疵的克隆,重要的是制备过程中使用的其他核酸(基因组DNA和RNA)、蛋白质和化学污染物的纯度。DNA纯度的良好指标是在230,260和280nm处的吸光度测量。在260和280nm波长下测量的吸光度比应该下降到1.8 - 2,并给科学家一个相对于蛋白质污染物的纯度的指示。260和230 nm的比应该下降~2 - 2.2,并提供了与质粒提取过程中使用的硫氰酸胍和盐酸胍等chaotropic agents的纯度指示。

浏览质粒可作为克隆级DNA!

克隆
图2:使用克隆级DNA将你感兴趣的基因直接克隆到质粒主干中。

DNA转染级别

转染
图3:需要将质粒引入哺乳动物细胞吗?使用转染等级DNA。

转染是在哺乳动物细胞中插入外部质粒的过程,可能需要每种反应的微量质粒DNA。结果,该技术的制剂必须更大,以允许提取足够的质粒持续多个实验。

转染级DNA的另一个基本方面是纯度。除了不含任何核酸和化学污染物,这些DNA样本还必须完全不含内毒素。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种脂多糖E杆菌这影响了组织培养细胞系的生存能力,降低了转染效率,最终影响了实验的质量和结果。由于这些原因,市面上的试剂盒提供了额外的清洗步骤,有利于这种试剂的去除,以增加转染的成功率。

总之,事先确定如何利用质粒DNA是很重要的,这样你就可以决定在数量和纯度方面最优的质粒制备类型。

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主题:质粒克隆,质粒

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