质粒101:CCDB - 有毒克隆的有毒关键

由Michael G. Lemieux

如果你对克隆感兴趣,你可能会意识到目前有几种方法可以用于克隆。这些包括传统的限制酶/连接酶介导的方法,最近开发的吉布森装配克隆Gateway®克隆技术,以及其他几种。每种方法都是独特的,并依赖于克隆反应的关键的特定组分。了解特定组件对于为您自己的实验选择正确的克隆方法至关重要,我们将专注于使流行门户的独特基因TM值可能的方法:CCDB.。但是是什么CCDB.,它在现代克隆中扮演了什么角色,为什么你应该了解更多?继续读下去,看看是如何做到的CCDB.可以让你的克隆实验更容易一点。

传统克隆的最耗时的方面之一是识别实际包含您感兴趣的插入的克隆。简单地说,CCDB.通过选择没有占用插入的向量使克隆更容易。但是究竟是怎么做的CCDB.做到这一点的?让我们从基因的简史开始,以及分子生物学家是如何利用它来进化克隆技术的。

CCDB:有效的毒素......

ccdB pKIL18/19质粒图谱CCDB.基因,位于F性因子质粒上E.科利,是由CCD操纵子编码的毒素-抗毒素系统的一部分,负责细胞分裂过程中质粒的维护。CCDB.可作为DNA乙酶毒物的有毒蛋白质(CCDB)的典范,用破碎的双链DNA锁定DNA乙酶,最终导致细胞死亡。CCDA,是在ccd操纵子中发现的另一个基因,它编码抗毒素蛋白(CcdA),保护细胞免受有毒CcdB的伤害。细胞失去CCDA通过F质粒的丢失,屈服于CcdB的毒性。

...成为一个强大的克隆工具

分子生物学家首先看到该系统大约20年前提高克隆效率的潜力,并开发了克隆向量来利用它。这些载体称为PKIL18和PKIL19,包含了CCDB.框架中的基因与mcs。大肠杆菌用空载体转化为表达CCDB.因为CcdA无法中和毒素,所以无法繁殖。然而,如果研究人员成功地将一个插入物克隆到载体中,那么CCDB.读取框架将被破坏允许表达重组质粒的细胞繁殖。含有非重组载体的任何细胞(例如重新连接空向量)仍将表达CCDB.因此会死亡。这一步骤极大地减少了不含重组质粒的克隆数量,因此使克隆过程更加有效,因为人们不必彻底筛选插入物的菌落。

Gateway®技术(由Invitrogen.TM值)本质上是这个旧系统的一个更现代的版本,附加的优点将在另一篇文章中详细讨论。专注于CCDB.方面,网关利用相同的原理,即细胞在表达基因的同时不会传播。简而言之,该系统中的矢量“骨干”包含CCDB.。成功的插入将完全取代CCDB.带着调查人员的兴趣。因此,正确的克隆可以更有效地识别,因为那些不包含所需插入的克隆不应该增长。

CCDB网关克隆

CCDB抗性大肠杆菌菌株使系统完整

CCDB.单独并不是系统唯一的关键 - 如何使用杀死表达细胞的质粒/基因?答案在于特殊的菌株大肠杆菌耐受毒素基因的表达。一种这种应变是DB3.1.,其中含有DNA旋转酶(Gyra462)的突变版本,其耐受CCDB的毒性作用。另一种可商购的CCDB抗性菌株是CCDB Survival™从表达载体TM值。使用DB3.1或ccdB生存TM值,人们可以有效地繁殖和预备含有的质粒CCDB.基因,然后可用于下游克隆应用。虽然这两种菌株最终执行相同的功能,但有一些证据表明ccdB Survival™可能更难转化,这取决于所使用的特定质粒。

我们还需要注意的是,尽管DB3.1和ccdB存活菌株是专门针对含ccdB的载体开发的,但任何含有F质粒(F’菌株)的质粒也将对ccdB产生耐药性,因为本地ccdA将会存在。最常见的克隆菌株大肠杆菌不含F质粒(被认为是F-);然而,也有一些流行的实验室菌株,如NEB Stable, JM109, XL1 Blue或XL10 Gold,是F '。这些菌株可能用于繁殖和准备您的ccdb空骨干,但绝不应在选择重组质粒时使用。查看我们的博客帖子普通实验室大肠杆菌菌株更多应变信息。

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参考文献

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4.F质粒CcdB蛋白通过旋转酶诱导有效的atp依赖的DNA裂解。中国生物医学工程学报。1993年12月5日;PubMed.PMID:8254658

5. Bernard,P.和Couturier,M。“F质粒CCDB蛋白的细胞杀死涉及DNA-拓扑酶II络合物中毒。”J Mol Biol。1992年8月5日; 226(3):735-45。PubMed.PMID:1324324

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