质粒101:菌落PCR

由贝丝学会主席

本文由嘉宾博主Beth Kenkel撰稿,她是爱荷华大学儿科部的研究助理。如果你对客座博客感兴趣,让我们知道!

分子克隆需要一些菌落筛选方法对于插入的存在。传统上这是用限制性内切酶消化;然而,菌落PCR可以在更短的时间和更少的钱完成同样的事情。菌落PCR的关键步骤是:1)设计引物检测插入物的存在;2)以裂解菌上清为模板,建立标准的PCR反应(引物、dNTPs、聚合酶);和3)在凝胶上运行PCR产物,分析产物大小。这篇博文讨论了在进行菌落PCR时需要考虑的一些关键问题。

菌落PCR概述

菌落PCR引物设计

菌落PCR的第一步可能也是最重要的一步是设计引物。引物设计有3种策略:1)插入特异性引物,2)骨干特异性引物,3)定向特异性引物。

菌落PCR引物类型

  1. 插入特定引物:插入特异性引物被设计为对插入特异性序列进行退火。这是一种“是或不是”的测试,阳性克隆放大一个产品,阴性克隆没有产品。此外,这种引物只能告诉你你的插入物是否存在,而不能告诉你它的方向是否正确,或者它是否在你的质粒主干中。

  2. Backbone-specific引物:第二种选择是设计骨架特异性引物。这些引物被设计用于退火到插入位点侧面的位点。没有插入的阳性克隆将比阴性克隆产生更大的产品。这种类型的引物对可以告诉你插入物的大小是否正确以及它是否在你的主干内。这种类型的引物对也适用于筛选具有相同主干但包含不同插入物的克隆。当你设计引物在克隆位点外退火时,插入物的序列是什么并不重要,允许你使用相同的引物对来筛选许多不同插入物的存在。缺点:这种类型的引物不能提供关于插入物方向的信息。

  3. Orientation-specific引物:如果您需要关于插入方向的信息,那么您可以考虑设计方向特定的引物。钝端克隆是您可能想知道插入方向的一个例子。这种引物对的一个成员退火到插入物侧面的序列和一个引物退火到插入物。创建这类引物对的一个简单方法是将插入特异性引物和骨干特异性引物混合匹配。

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每种方法都有优点和缺点,总结如下表。使用的引物类型取决于您的偏好。无论哪种方法,确保在使用菌落筛选前测试你的菌落PCR引物。最好的方法是使用带有或不带有插入物的载体来验证引物扩增了预期大小的PCR产物。

引物设计 优点 缺点
插入特定
  • 简单的“是或否”测试结果
  • 没有告诉你插入物的方向或者插入物是否在质粒中
  • 必须为每个插入物做一个新的引物对
Backbone-Specific
  • 提供关于插入物大小和是否在质粒中的信息
  • 因为引物依赖于质粒,所以可以用于筛选具有相同主干的克隆
  • 不提供关于插入方向的信息

ientation-Specific

  • 告诉你插入的方向
  • 告诉你插入物是否存在于质粒中
  • 很适合钝端克隆
  • 你必须为每个插入物做一个新的引物对,因为引物是插入依赖的

PCR设置

建立殖民地PCR反应与制备标准PCR反应几乎相同:将模板、引物、聚合酶和dNTPs结合,然后用标准PCR热循环程序孵育。一个关键的区别是质粒DNA必须从细菌中释放出来才能作为PCR模板。下面是关于这一点和其他一些菌落PCR提示。

  1. 准备模板:用无菌扁平牙签或吸管尖挑选一个菌落,并在少量无菌水中旋转。根据你的无结扎控制板上背景菌落的数量,总共选择3-10个菌落进行测试。背景越多,需要筛选的菌落就越多。

  2. 为以后的培养保存克隆在这一点上,你会想要保留你的克隆版本以供以后使用。有几种方法可以做到这一点。如果你打算在同一天完成你的菌落PCR分析,你可以保存剩下的细菌-水悬浮液,用它们开始培养你的阳性克隆。如果你想长期保存你的克隆体,只要在一个磅板。你可以用这个培养皿进行液体培养。最后,你可以开始用你挑选的克隆体进行小规模的隔夜液体培养,只对阳性的进行小型准备。无论您选择哪种方法,请确保使用适当的方法抗生素的选择

  3. 细菌裂解和PCR反应的建立:剩余的菌水悬浮液将作为PCR反应的模板。你只需要溶解细菌释放质粒DNA,要么在使用前简单煮沸样品,要么直接加入少量的样品到PCR反应中。在PCR反应的初始加热阶段,细菌将被裂解。一个标准的Taq聚合酶就足够了。

  4. 控制:控制可以成就或破坏一个实验。菌落PCR的最佳对照是用于验证菌落PCR引物是否首先起作用的相同对照:有插入物和没有插入物的主干载体。这些对照是快速参考,您可以使用在凝胶上运行PCR产物,以确定菌落是否包含插入物。它们也可以作为PCR反应的对照。运行一个无模板控制的PCR反应来检测污染也是一个好主意。

在凝胶上分析PCR产物大小

菌落PCR琼脂糖凝胶

现在你的PCR完成了,是时候运行产物琼脂糖凝胶,以确定其大小。确保使用一个适当的分子量标准作为参考,并在将样品移到凝胶上之前添加甘油负载染料。上图总结了前面描述的三种引物的一般预期结果。当使用插入特异性引物(1)时,阳性克隆(+)会产生条带,而阴性克隆(-)不会。骨架特异性引物(2)为阳性克隆(+)提供比阴性克隆(+)更大尺寸的产品。最后,定向特异性引物(3)给出与插入特异性引物相同的带(+)或没有带(-)结果,但也告诉你插入是否有正确的方向性。

用桑格测序来验证插入序列

在确定几个阳性克隆后,最后一步是mini-prep这些克隆并提交质粒用于Sanger测序。测序可以确认插入的序列,插入方向,以及质粒和插入DNA之间的连接序列。菌落聚合酶链反应(Colony PCR)将大大减少你需要发送测序的克隆数量,但不会告诉你你的产品是否有任何突变。

有很多不同的克隆策略但不管你最喜欢哪一种,菌落PCR都是分子生物学工具包中一个有用的工具。下次你筛选阳性克隆的时候考虑试一试吧!

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板凳上的技巧

  • 不要选择太大的殖民地。太多的细菌会抑制PCR反应或导致非特异性产物出现在凝胶上。

  • 谨防误报。仅仅因为你得到了预期大小的PCR产物并不意味着你的插入物中没有突变。在继续您的实验之前,请确保提交多个阳性克隆进行测序,以验证插入序列。

  • 放大子越短越好。更短的扩增子使PCR程序更短,更有可能在有细菌碎片的PCR反应中起作用。

  • 使用积极的控制。用相同的主干质粒转化的细菌是一个很好的阳性对照。如果对照没有扩增产物,那么你就知道可能是PCR设置和/或引物设计出了问题。

  • 使用阴性对照菌株。一个好的阴性对照菌株是你用于克隆的同一菌株的未转化培养物。这种类型的控制对于插入特异性引物尤其重要。如果你的阴性对照扩增了预期大小的产物,你就知道你的细菌的基因组已经包含了你的目标序列。


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贝丝学会主席贝丝·肯克尔(Beth Kenkel)目前是爱荷华大学儿科系的研究助理。她对科学传播和体外诊断特别感兴趣。

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主题:质粒101,分子生物学协议和提示,聚合酶链反应,质粒

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