质粒101:门户克隆

由Maria Soriano

当面对克隆项目,科学家不再局限于传统限制性内切酶克隆。相反,你可以选择一个将与给定的资源集,时间和实验需求一起使用的分子克隆技术。由于其在20世纪90年代后期,网关克隆技术已经变得非常流行,以便将DNA序列移动到多个载体系统中的快速和高效的方法。利用适当的入口和目的地向量,可以使用网关来克隆感兴趣的基因进入各种表达系统。继续阅读以了解有关网关克隆方法及其优势的更多信息。

介绍网关技术

由此开发的网关克隆方法Invitrogen.,是一个体外当噬菌体感染细菌时发生整合和切除重组反应的版本。一世n vivo.tHESE复合反应被促进了从噬菌体中重组附着位点(att.P.)和细菌(att.B.)。由于attP和attB位点之间的重组,噬菌体整合到细菌基因组中,并有两个新的重组位点att.L.离开了,att.R.-right-,图1)。在某些条件下,att.L.att.R.位点可以重组,导致噬菌体从细菌染色体的切除和再生att.P.att.B.网站。

Lambda Phage集成和切除

网关类的修改版本att.遗址让科学家们可以容易地克隆他们所需的DNA序列。网关技术依赖于下面描述的两种反应:

英国石油(BP)的反应发生在att.B.侧翼插入的网站和att.P.供体载体的位置。这个反应是由BP克隆酶混合酶催化产生的进入克隆包含目标DNA的侧翼att.L.网站。作为反应的副产品,CCD.B.基因从供体载体切除。

网关BP和LR反应

LR反应发生在att.L.生成的条目克隆和att.R.目标向量的位置。这个反应是由LR Clonase酶混合物催化的。结果,表达克隆感兴趣的DNA侧翼att.B.网站生成。和BP反应一样,含有的DNA片段CCD.B.基因从目的地矢量切除

一旦进行了BP和/或LR反应,下一步就是转化称职大肠杆菌细胞,选择阳性克隆。进入克隆和目的载体携带不同的抗生素耐药标记物(此处以质粒颜色表示),可以方便地选择表达克隆。您还需要使用大肠杆菌应变敏感CCDB.例如Mach1 DH5α,全球)。这CCD.B.基因存在于供体载体中目标向量在重组之前,在BP或LR反应期间,它与感兴趣的基因交换。自从此以来CcdB蛋白质抑制CCDB敏感的生长大肠杆菌菌株,大多数菌落应该包含所需的重组结构。阅读我们最近的质粒101帖子CCDB.想要查询更多的信息。

如何使用Gateway技术进行克隆

为了更好地理解这一过程,我们将介绍一个示例实验,我们可能使用Gateway克隆来生成我们想要的结构:人类KRAS基因在哺乳动物细胞中的慢病毒表达。

步骤1:生成一个条目克隆

有几种不同的方法可以产生所需的入境克隆 - 人类喀斯特侧翼attL网站。

方法A:复合的att.B.-PCR产品或者质粒att.P.捐赠者vector.在这种情况下,我们将使用PCR来添加att.B.站点的两端喀斯特编码序列。如果你选择了这个策略,重要的是要包含适当的蛋白质表达元素(核糖体识别序列、起始密码子、终止密码子、阅读框架考虑等)这个视频演示如何使用Scangene计划设计网关质粒。

attb pcr.png.

方法B:克隆对象中所需插入的att.L.-Entry-Topo矢量。Topo Cloning增加了短期,以促进克隆到一个att.L.包含输入向量。

威尼斯平底渔船cloning.png

方法C:限制克隆含有兴趣DNA的限制酶片段的含义和aatt.L.-entry矢量。该片段插入一个多克隆站点(MCS)中att.L.包含输入向量。

限制克隆

专家提示:Addgene也现成的条目克隆可用于许多流行的基因,包括hs.kras4a.。使用我们的网站来搜索你最喜欢的基因!

步骤2:生成一个表达式克隆

在进行表达克隆时,选择最适合你的实验的目标向量是很重要的。这一选择将取决于许多因素,如你的有机体、期望的表达水平和实验目的。对于哺乳动物慢病毒的表达,我们可以使用像pLenti CMV Puro DEST (w118-1)或十氧环素 - 诱导pLIX_402。被选中的att.R.目的地矢量将重新组合T.L.- 输入克隆以创建表达式克隆。

生成表达式克隆

第三步:表达你感兴趣的基因!

请务必验证表达式克隆的完整性通过测序或限制消化!然后,您可以转换或转染您想要用于实验的细胞,并验证您的构造是功能性的。

网关克隆方法的优点

兼容性和灵活性

一旦用您的DNA序列生成进入克隆,您就可以在只需一个重组步骤中在任何表达系统上移动该DNA片段。Addgene的现成进入克隆可与各种质粒一起使用。

速度

Gateway系统可以在1天内生成表达结构,而传统的限制和连接克隆需要2天以上。也可以在同一试管中建立BP和LR反应,加快克隆速度att.B.-PCR产物直接进入目的载体。克隆过程是简单的-没有限制,连接或凝胶纯化步骤是必需的!

多个片段克隆

你可以使用网关克隆将多个DNA片段插入到同一试管中的多个载体中。你可以克隆多达4个DNA片段,以特定的顺序和方向,在一个试管中,进入一个Gateway载体,以产生所需的表达克隆。这多亏了网关向量的设计。他们有修改版本的att.B.P.L.R.重组非常具体和方向的网站:att.B1.网站只反应attP1网站;attB2只有attP2attl1.只有attr1.;attl2.只有attr2.等等。看看Addgene公司提供的一些Gateway多位点质粒,包括Frew实验室多重慢病毒表达系统(MULE)套件, 这多路网关克隆套件多点网关质粒

常数阅读框架

当你将DNA片段从一个“网关”载体移动到另一个载体时,插入的DNA片段保持在框架内。

效率高

用于网关克隆的阳性(抗生素)和阴性(CCDB)选择标记可以将克隆效率提高至> 99%。

普遍性

所有类型的DNA片段都可以克隆:PCR片段,cDNA或基因组DNA,并可用于从哺乳动物到所有种类的生物体大肠杆菌

网关克隆载体术语表

向量类型 矢量特征 目的
捐赠者向量 attP网站的重组;CCDB.基因为负选择 使用克隆att.B.-有兴趣产生的侧翼基因进入克隆
入口矢量 attL网站的重组 用于生成进入克隆经过Topo Cloning.或通过限制克隆
目标向量 attR网站的重组;CCDB.基因为负选择;表达适当系统中感兴趣基因的元素 与条目克隆重新组合以生成表达克隆

准备尝试出网关克隆?

世界各地的许多科学家已经生成并存放了他们自己的与Addgene通路兼容的质粒。这些基因可以用来表达多种模式生物的基因。使用下面的链接为你感兴趣的生物体找到Gateway质粒:

在这里找到网关克隆质粒!


点击下载Addgene的质粒101电子书

参考文献

1. Chee Jy,Ch CF(2015)网关克隆技术:优点和缺点。克隆转运4:138。DOI:10.4172 / 2168-9849.1000138

2.哈特利JL。网关系统在多个主机中使用蛋白质表达。Curr Protoc蛋白质SCI。2003年2月;第5章:第5.17章。PubMed.PMID:18429245

3. Ptashne,M.(1992)。遗传开关:噬菌体(Lambda)和更高的生物(剑桥,马:电池压力机)。

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

在Addgene.org上的资源

话题:质粒101.质粒克隆质粒

留下你的评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅