质粒101:吉布森组装和其他基于长同源性的克隆方法

brook pyhtila

在过去的十年中,科学家们已经开发和微调了许多不同的方式来克隆提供吸引人替代品的DNA片段限制酶克隆。这些较新技术已经变得越来越普遍,并且有充分的理由。它们提供了与传统的限制酶克隆相比,我们曾经专门依赖的传统限制酶。在本博客文章中,我将占据一些优点,缺点,以及科学家如何使用Gibson组装将DNA片段组合在一起。

作为一种有趣的方式,我强烈推荐观看这个娱乐视频由我们的朋友创造的剑桥2010年IGEM团队这描述了Gibson组装作为“蒂芙尼早餐”的模仿的基础知识。

吉布森大会概述

吉布森组装技术是由Daniel Gibson博士和J.Craig Venter Institute的同事描述的首次描述于2009年。在Addgene中,我们将此选项添加到我们的常见克隆选项的下拉菜单中存款过程2014年由于其受欢迎程度。众所周知,吉布森组装众所周知,允许易于组装多个线性DNA片段,但也可以用于嵌件的基本克隆到您的选择载体中,如下图所示。为了开始,您需要在其末端具有具有同源性区域的DNA片段,其通常由PCR产生。然后,将片段与酶主混合物一起温育,该酶含有三种不同的酶:

  • 一种外切核酸酶,其咀嚼碎片的5'末端,产生长悬垂,使单股地区具有同源性与退火
  • 一种聚合酶,填补空白
  • DNA连接酶,密封退火和填充间隙的缺口

关于这种酶混合物的大部分是它们可以在相同的温度下工作,因此整个反应需要每小时或更少完成在50℃下完成。一小时左右后,样品立即准备转变为珍直的细胞。酶的主混合物可以从公司(例如NEB或SGI-DNA)购买,或者可以混合自己(例如,看到米勒实验协议)。Gibson组装过程可用于在一步中组装多达6个碎片,导致无疤痕组件,不需要特定限制性位点(或缺乏其)也不需要严重的时间承诺。另一个优点是该过程使得易于同时产生野生型和突变构建体,而不是顺序。

吉布森装配一插页

吉布森装配如何工作?

可以通过PCR扩增与含有适当同源序列的引物产生相邻片段之间所需的同源性。NEB推荐重叠为15-40bp,引物熔化温度大于48℃。Snapgene和NEB都具有帮助您设计PCR扩增碎片的引物以纳入这些同源区域的工具。这个视频有助于展示如何使用的Snapgene的程序为吉布森装配设计底漆。

有关使用Gibson组件的简单示例,想象您希望将您的感兴趣的基因插入到具有大的向量中标签在n-terminus,但您没有您想要使用的矢量中已包含的标签。如果通过限制酶克隆插入这两片DNA,则必须分两步进行,并且可能留在两个碎片之间。但是,通过使用Gibson组件,您可以在一个步骤中插入感兴趣的基因和标签序列的一步,而不是如下所示的疤痕。首先,您需要设计引物以放大两个片段,同时还包括对载体或相邻片段的同源区域的区域。然后,您将通过PCR放大碎片和向量,验证您是否具有正确尺寸的频段,并净化DNA片段。最后,您只需将这三个碎片孵育在一起,以及Gibson装配主组合1小时,然后转化为态度。该反应的成功率通常相当高,因此通常不需要筛选大量的菌落。除了获取底漆需要的时间,您可以在5天内制作您的构造。

吉布森装配有两个插入物

Gibson组装技术的一个缺点是该过程最佳地适用于200克多核苷酸的碎片。这可能是因为在发生退火和聚合步骤之前,外切核酸酶可以通过短于200个核苷酸的整个片段来咀嚼。其次,如果片段的末端具有稳定的单链DNA二级结构,则不起作用,例如发夹或茎环(如可能预期发生在终止子序列中),因为这将直接竞争所需的相邻组装碎片的单链退火和启动。

Gibson组装通常用于合成生物学,主要是因为在一步中易于组装多个片段,在一步中没有疤痕序列留在最终产品中。与用限制摘要留下的较小的重叠序列相比,片段之间的长重叠区域还更好地确保片段的正确装配顺序。2013年的一项研究发现,Gibson组装是最常用的装配方法之一(kahl 2013.)。然而,Gibson组装不是合成生物标准的理想选择,它依靠实验之间的零件的重复使用。在Gibson组装中,必须设计和订购每个片段的长底漆,并且对每个片段都有特定于您想要的片段,因此这不允许混合和匹配许多不同的片段。围绕这的一种方式是使用具有重叠区域的标准序列的组合,例如在壳体的情况下莫代尔(带链接器的模块化重叠定向程序集)为重叠定向方法带来模块化(Casini 2014.)。在这种情况下,在同源区域之前添加接头序列,其允许混合和匹配部件。

浏览质粒可用作克隆等级DNA!

吉布森大会遇到了Crispr

吉布森可以适应更复杂的克隆方案,例如你想要使用的矢量非常大的那些,具有高的GC内容,包含很多重复 - 任何一个都可以使PCR步骤变得困难 - 或者没有方便的限制性位点进行线性化。这是使用Gibson组装与流行相结合的理想情况CRISPR技术并在最近由奴才实验室发布(王,等。2015年)。在这种情况下,而不是使用限制酶或PCR来制备线性化载体,Cas9酶以及特异性GRNA用于切割22KB载体。随后是上述标准Gibson组装技术,这导致直接和无缝克隆到没有其他方法的载体中。最近还描述了使用Gibson组装以及CRISPR的第二个例子(江等人。2015年),其中细菌染色体的非常大的片段(最多100kb)通过CRISPR特异性地切出,然后使用Gibson组件组装成载体。在这种情况下,载体被PCR扩增以含有细菌染色体片段的同源区域。CRISPR切割用于规避PCR扩增染色体的碎片的需要,这在技术上具有挑战性。

基于其他同源性的技术

我们已经描述过序列和结扎独立克隆(SLIC)在先前的质粒101柱中。虽然SLIC可能更具成本效益,但吉布森大会改进了SLIC方法的两个方面。首先,它使用专用的5'外切核酸酶,而不是使用T4 DNA聚合酶的外切核酸酶特征,其必须通过DNTPS的存在或不存在来控制。其次,在Gibson组装中,添加了一个连接酶来修复缺口体外,在切片中,这些构造是修复的体内,最终效率较低。

除了SLIC和Gibson之外,还有更多的基于同源性的组装方法 - CPEC(圆形聚合酶延伸克隆)和切片(无缝结扎克隆提取物)来说是另外两个。同样地,有几个可用的商店购买的克隆套件,全部基于长重叠区域,对限制酶没有任何要求,并且片段之间没有瘢痕序列。其中一些产品包括:

虽然这些套件可能会以高价格出现,但其制造商涉及效率和低时间承诺。这些套件还具有特定的协议,用于插入产品的比例的建议,以及引物设计的工具,因此最好能够使用您将使用的特定工具包的特定制造商的说明进行办理入住手续。其中一些产品可能提供吉布森组装不增加效率,更短的孵化时间或容纳较小碎片的能力等优势。

知道你的克隆方法

还有另外两种常见的克隆方法,很容易与Gibson组装混淆(它们都以G!)开始,但实际上是通过显着不同的方法工作。金门克隆确实导致片段的无缝连接,但使用位点特异性限制性位点(IIS型限制性内切核酸酶)来切割识别序列之外的DNA。这要求载体和DNA片段在正确的位置含有这些位点,而不是在插入的中间。网关克隆利用λ整体酶催化通过整合酶识别的attB和ATTP位点的正交版本侧翼的DNA部件的定向克隆。该方法需要含有这些集成位点的专门载体并在片段之间留下疤痕,但允许将DNA片段从一个载体易于移动到另一个载体。

这些天有很多不同的方式来克隆。Gibson和其他基于长同源性的克隆方法是标准限制/结扎,网关或金门克隆方法的有用替代品。无论是用于常规克隆,多个碎片组装还是合成生物学,你应该考虑试一试!

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参考:

1. Gibson DG,Young L,Chuang Ry,Venter Jc,Hutchison Ca 3rd,Smith Ho。DNA分子的酶促组装高达几百千碱基。NAT。方法2009;6,343-345。PubMed.PMID:19363495.

2.王杰,王A,李克,王b,金s,重新坐标m,洛克琴rf。CRISPR / CAS9核酸酶切割与Gibson组件结合无缝克隆。Biotechniques 2015;58:161-170。PubMed.PMID:25861928

3.姜W,赵X,Gabrieli T,Lou C,Ebenstein Y,朱TF。Cas9辅助靶向染色体区段捕获使得能够实现大型基因簇的一步靶向克隆。NAT Communce。2015;SEP 1; 6:8101。PubMed.PMID:26323354。pmed中央PMCID:PMC4569707。

4. Kahl,L.J.&Endy,D.对合成生物学促进技术的调查。J. Biol。eng。2013;7,13. PUBMEDPMID:23663447。pmed中央PMCID:PMC3684516。

5. Casini,Arturo,等。“合成生物学的一锅DNA结构:具有连接器(模态)策略的模块化重叠定向组装。”核酸研究42.1(2014):E7-E7。PubMed.PMID:24153110。pmed中央PMCID:PMC3874208

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