伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:绿色荧光蛋白(GFP)

由Marcy Patrick.

GFP小鼠来自蛋白质的生物发光和荧光,如绿色荧光蛋白(GFP)可能已经在水母等生物中存在了数百万年;然而,直到20世纪60年代,科学家才开始研究绿色荧光蛋白,并推断出它的生化特性。现在,GFP及其荧光衍生物已成为实验室的主要研究对象。GFP被广泛应用于生物学科的研究,科学家们将GFP应用于多种功能,包括:标记基因以阐明其表达或定位谱,作为生物传感器或细胞标记,研究蛋白质-蛋白质相互作用,可视化启动子活性,等等。

阅读以了解有关GFP的更多信息,科学家如何发展这种多功能蛋白质以适应他们的实验需求,以及实验室中的一些常见应用。

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为什么是绿色荧光蛋白?

GFP是一个〜27kDa蛋白,由238个氨基酸组成,衍生自晶体水母Aequorea victoria。它在可见光谱的绿色部分中具有荧光发射波长(因此名称),这是由于由蛋白质中心的三种特异性氨基酸的成熟反应形成的发色团(Ser65,Tyr66和Gly67)。在首次发现时,GFP最令人惊讶的方面之一是发色团的自发形式,无需额外的共同因子,底物或酶活性-它只需要在成熟过程中氧气的存在。这意味着蛋白质可以直接从A.维多利亚并在任何生物体中表达,同时仍然保持荧光。

蛋白质结构在1996年首次报道,是一种含有11个含有含有11℃的“桶”形状,用发色团隐藏在结构的中心,通过含水溶剂屏蔽猝灭。这种紧密包装的结构解释了整个GFP蛋白的重要性,这几乎完全需要维持荧光活动;然而,容忍截断的截断,但是,点突变是可接受的。GFP对常规荧光染料的主要优势是由于它是无毒的并且可以在活细胞中表达,从而能够研究动态,生理过程。

重新设计GFP以增加其颜色和应用范围

酵母膜蛋白

几乎在其序列阐明后,科学家通过诱变开始工程新版本的GFP,以改善其物理和生化特性。1995年,Roger Y. Tsien描述了一种增加荧光强度和荧光强度的S65T点突变耐光性GFP。这也使其主激发峰从395 nm转移到488 nm,有效地改善了野生型蛋白的缺陷,促进了其在研究中的广泛应用。自那以后,许多其他的突变被引入到绿色荧光蛋白中,新的荧光团迭代不断地被设计出来。表1下面列出少数常见的荧光蛋白及其相对于野生型伟德2021足球欧洲杯买球平台GFP的突变。虽然这里未列出,但是在每种颜色内的许多渗透也存在,只有略有变化,分离它们。

请注意在光谱的红色侧发现许伟德2021足球欧洲杯买球平台多荧光蛋白不是GFP衍生物,而是与分离的DSRED蛋白有关Discosoma sp。已经完成了类似的工作来扩大红荧光蛋白曲目;然而,这些蛋白质是GFP和突变定义的独特之处在表2中找到可能不适用。

表1:包含常见荧光团的特定突变

荧光蛋白 突变相对于Wildtype GFP
egfp. F64L;S65T.
EYFP. S65G;V68L;S72A;T203Y
mYFP S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y;A206K.
茶晶 S65G;V68L;Q69K;S72A;T203Y
ECFP. F64L;S65T,Y66W;n146i;M153T;v163a.
mCFP F64L;S65T,Y66W;n146i;M153T;v163a;A206K.
蔚蓝的 F64L,S65T,Y66W,S72A,Y145A,H148D,N149I,M153T,V163A
EBFP. F64l、s65t、y66h、y145f

表2:GFP衍生物中特定突变的功能作用

突变 已知功能
S65T. 增加荧光,光稳定性和主要激发峰的偏移至488nm
F64L 增加折叠效率37C.
y66w 使发色团形成吲哚而不是苯酚组分(青色衍生物)
Y66H. 蓝色移位波长(蓝色衍生物)
Y145F 增加了BFP的量子产量
Y145A和H148D 稳定结构蔚蓝的衍生品
F99S,M153T,V163A 改善37℃下的折叠,减少高浓度下的聚集
T203Y 波长红移(黄色导数)
A206K. 干扰二聚体界面(单体衍生物)
K26R,Q80R,N146H,H231L,(以及其他) 中性突变

众多的应用程序

由于其规模和易于使用,绿色荧光蛋白和其他荧光蛋白已成为分子生物学的支柱。伟德2021足球欧洲杯买球平台科学家们可以很容易地利用含有gfp的质粒作为一种手段达到许多功能目的。我们在下面列出了我们最喜欢的,但是目前还有很多其他的用途,新的GFP技术正在不断开发中!

  • 融合标签:最常见的用途之一,GFP可以融合到蛋白质的N-或C-末端,这允许科学家可视化基因表达的时间和地点。点击此处查看addgene的空骨干集的集合,用于构建荧光灯融合。

  • 记者:转录在对感兴趣的启动子的控制下放置GFP可用于有效监测给定细胞类型中的该启动子的基因表达。这种类型的转录报告是GFP最早使用的。

  • Förster共振能量转移(FRET):这用于研究两种蛋白质之间的相互作用或经历构象变化的蛋白质的两个结构域之间。使用典型的两个具有重叠激发/伟德2021足球欧洲杯买球平台发射光谱的荧光蛋白;一个融合到正在测试的每种蛋白质或域。在这里找到FRET质粒。

  • 将EGFP:FRET的替代品,分裂EGFP也用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。在这种情况下,两种EGFP融合到感兴趣的蛋白质,并且当它们接近时,EGFP的两半进行折叠,成熟和荧光。

  • 生物传感器:一种广泛的基于gf的荧光生物传感器被设计用于检测各种细胞内条件,包括离子(如钙离子)2+)浓度和pH,使用一系列策略,如褶皱,钙调蛋白和其他策略。在这里回顾Addgene收集的荧光生物传感器。

  • Optogenetics:科学家可以利用光来检测、测量和控制分子信号、细胞和细胞群,以便了解它们的活动,并将这些活动变化的影响可视化。在OpenOptogenetics了解更多关于光遗传学的信息在Addgene找到光电致动器和传感器。

  • 细胞标记/选择:像质粒等表达构建体通常包括GFP作为标记物,以帮助鉴定哪些细胞已成功升高质粒。这可以作为抗生素选择的替代品。这种类型的质粒可以在来自感兴趣的基因的额外启动子的控制下具有GFP,或者从与感兴趣的基因相同的转录物,但在内部核糖体进入部位(IRES)之后。这是与FACS相连使用的时间(见下文)。

  • 荧光激活的细胞分选(FACS):这是一种流式细胞术,根据荧光信号将混合的细胞分离成不同的细胞群。因此,FACS可以用于分离表达GFP的细胞和不表达GFP的细胞。

  • 发展/转基因用途:由于其稳定性,GFP可用于细胞命运研究中的谱系跟踪能力。它也可以用来,当把控制下的促进剂感兴趣,可视化的发展阶段,这些促进剂是活跃的。此外,GFP可以标记转基因的胚胎干细胞,用于植入和生成转基因小鼠。

  • 纯化:GFP可作为蛋白质纯化的通用表位标签,有许多商用的GFP抗体可供选择。

  • 其他:我们只是触及了GFP潜在应用的表面。它还被用于在药物筛选中识别特定的细胞群,在癌症研究中可视化裸鼠的微转移,作为DNA双链断裂修复的报告者,以及标记致病性细胞内微生物以可视化宿主/病原体相互作用。

你有喜欢使用GFP的最喜欢的方法吗?评论并告诉我们如何!

下周再来当我们将成为Gal Haimovich的Girver博客文章GreenfluorescentBlog.。GAL将分享他的名单选择最佳荧光蛋白时要记住10件事在您即将到来的实验中使用。与此同时,如果您没有检查GAL的博客,那么您应该!他对荧光显微镜的最新工具和技术有了很好的文章和洞察力。

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注意:A. Max Juchheim有助于写这篇文章。

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