恭喜，您有一种表达您感兴趣的基因（YGoi）的质粒，准备潜入您的功能实验！Whether you’ve cloned the plasmid yourself or obtained it from a colleague down the hall, it is always a good idea to take some time to confirm that you are working with the correct construct, and verify that the plasmid you received matches the expected sequence. Here at Addgene, we use基于NGS的质量控制确认我们分配的所有质粒的序列。这种方法是暂时的，所以我们推荐一个各种方式筛选和验证您的质粒。在这里，我们将介绍限制性摘要分析。
诊断限制摘要
诊断摘要可用于确认基于预测尺寸和组织的质粒的粗糙结构不同的特征在质粒中。即使您没有全质粒序列，也可以成功使用限制性分析。一旦纯化质粒DNA，该方法可以在不到一天的时间内完成实验室。诊断限制摘要由2个单独的步骤组成：1）用限制酶孵育您的DNA，所述DNA在特定位点处切割DNA分子，2）在琼脂糖凝胶上运行反应以确定所得DNA片段的相对尺寸。
限制性消化通常用于通过从主链中切除插入物来确认在特定载体中的插入物的存在。为此，您将使用与侧面插入物的限制性位点的酶。您需要知道近似大小矢量骨干以及插入物的预测尺寸。你可以搜索ncbi.对于ygoi，如果需要，可以找到特定的参考序列。
右侧的实施例质粒总尺寸为7.3kb，包括1.2 kB插入物。用2个独特的酶消化质粒（Hindiii和Bamhi）并在琼脂糖凝胶上运行。所得到的凝胶图像包括1kb梯子（泳道1），其具有范围为约500bp至10kb，其中3.0kb片段具有增加的强度以用作参考带。未切割的DNA（泳道2）显示出3种可能的质粒构象，具有弛豫和标有星号（*）的折叠。当质粒消化时Hindiii和Bamhi单独（泳道4-5），有一个7.3kb的一个带，代表质粒的全尺寸。HindiII和Bamhi（泳道3）的双重摘要在6KB和1.2KB（红色盒子）上产生带，分别匹配骨架和插入物。凝胶上的结果对应于预测的尺寸。
观看此视频，快速概述如何分析限制性摘要：
限制性摘要提示和技巧：
以下提示将使您更容易获取有用和信息丰富的诊断限制摘要。
为你的消化：
- 尝试选择独特的酶。只切割一次的酶允许您更容易，准确地可视化您的构造的全部尺寸。
- 考虑缓冲和温度兼容性用不止一种酶消化时。咨询制造商手册，以获得最佳的工作条件每种酶。
- 注意甲基化问题。Xbai和Clai等酶对甲基化敏感，并且它们的活性可能被阻断。如果您必须为消化器使用这些酶，您需要将DNA从DCM或甲基化缺乏的细菌菌株（如JM110或INV110）净化。
- 避免星星活动。一些内切核酸酶（例如BamHI）能够裂解其具有定义识别序列的相似但不相同的序列。大多数酶制造商制造高保真版本的内切核酸酶和/或将定制缓冲区提供定制缓冲器，作为避免此问题的手段。
为你的凝胶：
- 在浇注之前将溴化乙锭（ETBR）加入凝胶。ETBR与DNA结合，并允许您在紫外线（UV）光下可视化DNA。
- 不要忘记在加载它们之前将加载缓冲区添加到摘要反应。缓冲液中的甘油将确保样品在凝胶井中沉淀，染料提供视觉参考点，因此您可以轻松评估凝胶的运行程度。奖金：染料也是如此以预测的大小运行所以你可以估计你的乐队的凝胶率的距离已经达到染料！
- 始终运行梯子。梯子允许您解释您在样式车道中获得的乐队。根据预期的带尺寸选择梯形图。
- 始终运行控制未调控的DNA，以确保您的酶正在运行。当未被拆分质粒DNA被隔离并在琼脂糖凝胶上运行时，您可能会看到3个带。这是由于圆形DNA呈现出几种构象，最丰富的存在：超级硅化，放松和切口。如果你的摘要车道看起来像你未切割的车道，那么有点不对劲！
- 量化你的DNA。加载太多DNA将使难以获得脆带并分析结果。奖金：知道你在每个井中装载了多少DNA将允许您近似DNA质量相当强大的类似规模的样本。
- 在80-150V下运行凝胶，直到您在乐队之间具有良好的分离。当溴酚蓝染料线约为75-80％的凝胶时，凝胶将确保您保持较小的频段;但是，您可能需要运行凝胶以实现更长时间以实现较大的DNA片段的良好分离。
我希望这些提示表明质粒验证不仅仅是必要的，而且是一种简单的过程。请致防addgene的质粒验证资源找到关于主题的额外提示和详细协议如何设置你的摘要和浇注/运行DNA凝胶。
更多质粒探险资源：
话题：质粒101.那分子生物学协议和提示那质粒
发表评论