质粒101:质粒克隆中使用的筛选策略

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如果你克隆了一个质粒,你需要一种方法可以在干草堆中找到针:一个完美的克隆,其中包含你正在寻找的质粒的质粒。开始搜索的一种方法是使用选择策略,仅在哪里获得或丢失特定基因的细胞(例如:抗生素抗性标志物)。在以前的博客文章中,我们涵盖了如何使用质粒克隆中的阳性和阴性选择

但是,常时,选择策略是不够自己的,以帮助您找到所需的质粒。在许多情况下,您也需要一个筛选策略。在屏幕中,您并没有像在选择中一样杀掉一部分细胞。相反,所有细胞存活,您需要对它们进行排序以找到所需的克隆。

做你的选择,然后屏幕

为什么为您的克隆策略添加屏幕?屏幕将帮助您更轻松地识别成功的克隆,因此您必须在实验后通过更少的殖民地杂草。作为一个常见的例子,选择将使您含有含有质粒骨干的菌落,因为它通常依赖于抗生素抗性。但识别包含所需插入件的克隆怎么样?这是屏幕进入的地方。

让我们来看看ALL_IN_ONE_CRISPR / CAS9_LACZ.,来自的Crisprprng grna质粒Lynne Postovit的实验室。它含有骨干中的氨苄青霉素抵抗标志物。含有氨苄青霉素的琼脂的选择将产生占据该载体的细菌,但它不会告诉您载体是否包含GRNA插入物。但是,蓝白屏幕可以为您提供此信息(下面的更多信息)。电镀含有X-GAL的氨苄青霉素板上的转化允许您鉴定占用载体的细胞,并区分含有没有(蓝色)的GRNA(白色)的质粒。

让我们来看看一些筛选方法。

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广泛使用的筛选方法是蓝白屏幕,其依赖于Lacz.基因。Lacz.编码可以水解乳糖的酶 - 甘露出酶。幸运的是,对于实验室研究员,当基材X-GAL被 - 高烷基酶分解时,它变成了不溶性的蓝色颜料。

在Addgene中查找用于蓝白筛选的质粒!

一些细菌菌株含有Lacz.在他们的基因组中,科学家们发现当缺失一部分基因时,它产生非功能性 - 高烷基酶。通过表达该缺失部分,例如在质粒上,通过表达该突变产生官能团 - 高分子酶。蓝白色屏幕依赖于感兴趣的基因插入中间的载体Lacz.基因,从而破坏 - 溶解酶活性。这些细胞,大概是所需的细胞,不能分解X-gal,是白色的。不包含插入件的单元格是蓝色的。看看我们的蓝白筛选博客帖子有关更多信息。

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图1:蓝白屏幕的结果。图片来自Stefan Walkowski.

限制性消化

区分含有质粒的菌落的菌落的另一种方法是从不使用的插入物限制性消化。关键是关于您的酶选择的战略性。您需要选择将为您提供不同大小的频段的酶,具体取决于质粒是否包含您的兴趣插入。例如,选择仅在预期插入件的两侧切割一次的酶。如果质粒包含您的插入,您将看到两个频段:一个代表矢量骨干网,另一个表示插入件。如果质粒不含插入物,您只需看到矢量骨干频带。或者,您可以选择一种在质粒骨架中切割一次的酶,以及另一种切割插入物内的酶。如果质粒含有插入物,你将看到两个频段,但如果质粒没有,你只需看到一支乐队。这些只是您如何使用限制摘要来筛选克隆的几个例子,但是有许多其他方法可以为这种方法选择限制酶。

如果您计划进入这条路线,请在使用限制摘要中查看我们的协议视频以分析质粒,这可以帮助您可视化此过程,或访问我们的限制分析博客帖子

殖民地PCR.

菌落PCR可以使用裂解的细菌菌落检测DNA的存在或不存在,而无需制备质粒。在这种情况下,您将使用菌落PCR来检测您的插入件,无论是使用刀片特有的引物还是通过使用载体的引物特定但放大潜在插入物。如果您使用的是特定于插入的引物,则应期望PCR产品如果质粒含有插入物,如果质粒不含插入物,则不含有PCR产物。如果您正在使用传染媒介特定的底漆,请查找大小差异。您还可以使用引物在插入件中退火的引物,并将其他引物退火到骨架上。在这种情况下,如果质粒中没有插入物,则无法放大任何东西。就像任何实验一样,您希望您的PCR适当的正面和负面控制。

找到详细信息并了解更多信息这个博客文章中的殖民地PCR

菌落PCR的图解概述。首先设计引物,用于放大插入物。然后您设置PCR,并在凝胶上分析PCR产品。
图2:菌落PCR的步骤。

Sanger测序

Sanger测序确定DNA分子内核苷酸的精确顺序,在这种情况下是质粒。测序是最明确的方法之一,即知道您的插入是您所期望的。要开始,您将首先需要一个底漆来补充你的质粒序列。从一个骨干的特定于骨干的底漆开始,该底漆将在多个克隆站点(MCS)上序列并进入您的插入物。看看我们的矢量数据库寻找更常用的骨干网和特定引物的质粒图,您可以用来确认克隆。您也可以找到列表流行的测序底漆在我们的分子生物学参考中。

有时,常见的底漆无法提供您需要的所有信息,因此您需要设计自定义底漆。由于Sanger测序通常可以序列仅为1kB的DNA,所以定制引物特别有助于通过从末端测序来验证不达到的突变。想知道更多?访问此博客文章分析和排除Sanger测序结果的提示

在Addgene,我们现在使用我们的QC过程中的下一代测序。这样,我们可以确认整个质粒的序列。请注意,NGS验证比Sanger测序或上述其他技术更加冗余。

在分子生物学中,将基因克隆到您的质粒中通常是数字游戏。通过使用各种筛选和选择技术,您可以增加找到正确克隆的机会。

访问质粒101电子书(第2版)


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