质粒101:质粒克隆的阳性和阴性选择

由詹妮云顶娱乐 韦德国际弗曾

你已经努力工作了净化你的兴趣基因,让它进入你的质粒主干,将混合的DNA注入细胞。不幸的是,并不是每个细胞都能成功地吸收质粒DNA。其中一些含有你感兴趣的基因的质粒,但其他的会吸收质粒骨架,并重新连接到自己身上。

因此,你的克隆策略需要识别含有你要找的质粒构造的细胞。幸运的是,有很多方法可以做到这一点,包括积极选择、消极选择和/或筛选。我们将在这篇博文中关注积极和消极的选择,但是不要担心,我们将在以后的文章中讨论屏幕。

细菌克隆选择策略是只选择含有质粒的克隆

阳性选择:获得特定基因的细胞存活

在阳性选择中,只有包含特定基因的细胞存活。其余的没有增长。虽然有很多方法来设计你的积极选择策略,这里有一些需要考虑。

抗生素的选择

当插入的DNA包含抗生素抗性标记时,选择是简单的。后转换,将细胞置于含有相应抗生素的培养基上。例如,如果你插入质粒主干的DNA包含卡那霉素抗性盒,你就可以将细胞放在含有卡那霉素的琼脂上。只有携带含有卡那霉素耐药盒式质粒的细胞才能生长。

然而,通常情况下,质粒的主干包括一个抗生素耐药性盒,而你不会在你感兴趣的基因中引入一个额外的抗生素耐药性盒。在这种情况下,抗生素选择将选择已经被质粒主链转化的细胞(有或没有你插入的DNA),进一步筛选将帮助你确定质粒主链是否包含你感兴趣的基因。

营养缺陷型

除了抗生素的选择,你还可以利用细菌的特性,如原生营养,合成所有生长所需化合物的能力,或缺陷营养,不能合成生长所需化合物的能力,来成功地吸收你感兴趣的DNA。

如果你设计的实验使用的是一种缺乏营养的细菌菌株(一种不能合成必需氨基酸的细菌)和一种补充缺乏营养的质粒(即合成关键氨基酸的质粒),那么在克隆过程中缺乏营养和原生营养就会发挥作用。许多常见的E杆菌菌株用于克隆的是特定氨基酸的营养缺陷。在缺乏必需氨基酸的培养基上,细菌只有获得含有合成缺失氨基酸所需基因的质粒才能生长。

从那时起,缺陷营养选择就经常被用于酵母的克隆抗生素耐药性在酵母中自发产生。例如,马库斯Ralser美国的实验室发明了一种酵母原养型设备含有23个质粒来补充营养缺陷。

负选择:失去特定基因的细胞存活

与积极选择不同的是,消极选择意味着你选择的是基因产物的丢失——通常是有毒的东西。该基因在原质粒上发现,在基因内插入DNA片段或基因缺失可减轻其毒性作用。负选择有时被称为反选择。

Toxin-antitoxin系统

一种消极选择策略是毒素CcdB网关克隆通过包括利用此属性ccdB在目的地质粒上。在目的地质粒中ccdB基因的两侧是重组位点。为了将感兴趣的基因引入目的质粒,必须首先在基因的侧面添加重组位点。目的基因在质粒中成功的重组和整合ccdB基因和细胞只有在包含感兴趣的基因时才会生长。

SacB counter-selection

SacB counter-selection依赖于SacB基因产生的有毒产物。sacB来自革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌并编码酶左旋蔗糖酶将蔗糖转化为革兰氏阴性菌的有毒代谢物。在蔗糖培养基上电镀将选择含有失去细胞结构的细胞sacB基因。

SacB的用法与CcdB类似。例如在基因表达质粒中pGTvL1-SGC尼古拉Burgess-Brown的实验室,sacB基因在5%蔗糖板上进行阴性选择。交换的sacB目标基因的基因允许细菌在蔗糖上生长。

质粒克隆:利用自然发生的基因进行创造

在这篇博文的这一点上,你可能已经意识到积极和消极选择策略采用自然发生的基因来克隆(抗生素抗性基因,毒素基因,和sacB基因)。通过利用大自然的工具箱,科学家们正在寻找越来越多的方法来创造性地进行质粒克隆中的选择。

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