质粒101:蛋白质标签

作者:Eric J. Perkins

用于蛋白质标签

蛋白质标签通常是掺入翻译蛋白质中的小肽。如在随附的卡通中所示,它们具有多种用途,包括(但不限于)纯化,检测,溶解,定位或蛋白酶保护。到目前为止,质粒101已覆盖GFP及其相关的荧光蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台,有时用作检测的标签;然而,那些只是一种(承认大的)常见的融合蛋白标签。需要过表达和纯化蛋白质的生物化学师和分子生物学家可以根据他们的目标蛋白质面临任何数量的技术挑战。经过几十年来努力解决这些挑战,研究人员已经积累了一个相当大的标签和融合蛋白的分子工具盒,以帮助重组蛋白的表达和纯化。

标签的稳定性和溶解度

为了过度表达重组蛋白,克服的一些障碍是什么?它通常不适用于过表达蛋白质的最佳兴趣。能源和蜂窝资源正在花费以制造细胞不需要制造的东西。真核生物和一些细菌部署蛋白质以降解细胞可能考虑垃圾蛋白质的内容。虽然存在许多化学和肽的蛋白质组抑制剂,但是谷胱甘肽S转移酶(GST)可以融合到重组蛋白质以与谷胱甘肽进行一步纯化,也可以防止蛋白水解。

这是一种不稳定的形式。原核生物还可以具有困难的时间折叠真核蛋白。您可以获得细菌以产生大量的蛋白质,但如果它没有正确折叠,则没有必要结晶或测试其功能。小泛素相关的改性剂(SUMO)可以帮助折叠和稳定,与麦芽糖结合蛋白(MBP)有助于折叠和稳定性。过表达也可以导致不溶性,聚集蛋白质不是有用的蛋白质。MBP标签可以帮助解决溶解性问题,但科学家也可以选择添加较小的蛋白质,例如硫氧还蛋白(TrxA)它能促进二硫键的形成,从而保持蛋白质的可溶性。

用于亲和和纯化的标签

亲和标签,通常是一个相对较小的氨基酸序列,基本上是你的蛋白质的分子链。如果你正在研究一种没有特征的蛋白质,或者一种还没有开发出好的抗体的蛋白质(仅仅因为你的蛋白质有一种商业上可用的抗体,这并不意味着它是一种一),那么你检测、免疫沉淀或纯化该蛋白质的第一步可能是融合一个亲和标签到它。FLAG、血凝素抗原(HA)和c-myc标签多年来一直是亲和标签领域的重要工具,决定使用哪一种标签取决于您的应用(见下表)。这些抗体可以用于这些标签良好,可用于Western印迹,IP和亲和纯化。

可以说最简单的亲和标签是多组氨酸(His)标签。his标记的蛋白体积小,不太可能影响功能,可以使用金属亲和层析纯化,通常使用Ni2+柱。像其他亲和标签一样,His标签可以融合到蛋白质的N-或c -端。不像其他表位标记- - - - - -当加倍或三倍增加标签尺寸时- - - - - -修改多亚氨基氨酸的长度不会大大改变标签的大小。

表1:常见蛋白质标签

标签 抗原决定基 质量(kDa) 功能 笔记
CBP. KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL 4 亲和力和净化 结合和洗脱步骤使用非常适中的缓冲条件
旗帜 DYKDDDD DYKDDDDK DYKDDDK 1 亲和力和净化 适用于基于抗体的纯化;有固有的肠激酶裂解位点吗
销售税 大蛋白质 26 纯化和稳定性 含有谷胱甘肽的纯化;防止蛋白水解,但可能会减少溶解度
YAYDVPDYA或YAYDVPDYA或YDVPDYASL 1.1 亲和力 常用western blot, IP, co-IP, IF,流式细胞术;c偶而干扰蛋白质折叠
HBH HHHHHHANKA GEGEIPAPLA GTVSKILVKE GDTVKAGQTV LVLEAMKMETEINAPTDGKV EKVLVKERDA VQGGQGLIKI GVHHHHH 9 组合 由细菌衍生的体内生物素化信号肽(Bio)组成,由六三氨基基序(6xHis)侧翼
MBP. 大蛋白质 40 溶解性和纯化 可提高原核生物真核蛋白的可溶性和折叠性;用直链淀粉进行单步纯化,但规模巨大
Myc EQKLISEEDL 1.2 亲和力 常用于western blots, IP, co-IP, IF,流式细胞术,但很少用于纯化,因为洗脱需要低pH值
保利他 HHHHHH. 0.8 亲和力和净化 体积很小,很少影响功能
KETAAAKFERQHMDS 1.8 溶解度和亲和力 充电和极性残留的丰富可提高溶解度;适用于基于抗体的检测
SUMO. 〜100氨基酸蛋白 12 稳定 在n端,促进折叠和结构的完整性;劈得开的。对净化无益;在真核生物中可裂解
轻敲 Grripglinp wkrrwkknfi avsaanrfkk isssgaldyd ipttasenly fqgefglaqh deavdnkfnk eqqnafyeil hlpnlneeqr nafiqslkdd psqsanllae akklndaqap kvdnkfnkeq qnafyeilhl pnlneeqrna fiqslkddps qsanllaeak klndaqapkv danhq 21 组合 看文字
TRX. Msdkiihltd dsfdtdvlka dgailvdfwa ewcgpckmia pildeadey qgkltvakln idqnpgtapk ygirgiptll lfkngevaat kvgalskgql kefldanlag sgsgghmhhhh HHSSGLVPRG 12 Solubililty 帮助正确折叠
V5 gkpipnpllgldst. 1.4 亲和力和净化 适用于基于抗体的纯化

组合和裂解标签

通常,单个标签是不够的。如果需要一个标签来增加溶解度和一个标签进行净化?或者您想将荧光团与标签组合,该标签将您的蛋白质定位在核心中?或者你想要多轮净化以使您的蛋白质尽可能纯净?提供不同组合的载体标签很容易获得虽然将蛋白质添加太多标签和融合蛋白,但最终会弄得荒谬(你一般不比蛋白质不想要更多的标签),2-3标签越来越普遍。串联亲和力纯化(Tap)一旦具体地参考由钙调蛋白结合肽(CBP)的组合标签,Tev切割位点(在片刻中的更多)和2个Prota IgG结合结构域。TAP后来包含了几个其他的标签组合,尽管这些组合通常仍然包含至少一个来自原始TAP标签的元素。术语双标签和双标签也被使用。由于其体积小且易于添加到纯化方案中,His标签经常与其他标签结合进行双标记。

所有这些标签的问题都是其中许多人都服务于一次性目的,并且在此目的,您并不一定希望它们粘在一起。此时,蛋白酶可以成为你的朋友,而不是你的敌人。两个常见的标签(SUMO和标志)通过特定蛋白酶切割,而不需要添加独立的切割识别位点。事实上,Sumo不能用于真核生物,因为存在过多的SUMO蛋白酶,但与纯化蛋白质一起使用时,由于酶以与细胞的上下文相同的方式地切割SUMO标签。标志标签可以通过肠内酶切割,识别DDDDK ^ x,在赖氨酸后切割。这种裂解的效率取决于X的身份。

一些其他蛋白酶可获得,但科学家们需要将其识别位点纳入其蛋白质标签,以便有效地使用它们。最好的优化之一是烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶。TEV蛋白酶切割位点经常置于用于两轮纯化的两个标签之间,在柱子之间进行切割反应。通过用于增加其稳定性活性的各种突变,TEV蛋白酶本身可以用质粒容易地纯化在这张纸上找到(可以在Addgene)。

表2:与标签常用的蛋白酶识别位点

蛋白酶 识别网站 笔记
TEV ENLYFQS C在Gln和Ser残基之间
凝血酶 LVPRGS 克利夫斯arg和gly残留物之间
预备 LEVLFQGP 在gln和gly残留之间切割

本文不是所有标签的全面指南,而是简单概述科学家使用标签,其中几个时间测试的标签和融合蛋白作为示例。表列出了比帖子中描述的更多常见标记,但已被分类为帮助您更好地评估其功能。在提供的参考文献中可以找到更多详细信息和某些协议。


额外的资源:

Addgene页面和博客帖子的兴趣:

Eric感谢他的妻子,Annette Sievers博士的建议和指导。她提纯蛋白质的能力比他强多了。


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