质粒101：次级纳米胸泡工具箱

蛋糕。elisas。免疫荧光。所有这些技术有什么共同之处？它们通常需要次抗体，经常是小鼠或兔品种。虽然抗体肯定不是“破碎”，但它们的生产确实需要持续的动物牺牲。可以有替代方法进行免疫缩编吗？输入Gorlich实验室以及抗小鼠和-兔IgG二级纳米体工具箱。纳米体就像微小的抗体，对于上述所有的分子技术来说，它们的作用如果不是更好的话，也和抗体一样好，但它们也可以在细菌中表达，并用普通的蛋白质纯化方法提取。继续读下去，了解更多关于纳米体的知识，以及它们的结构和功能如何与IgG抗体相比较，以及如何生产它们用于你的实验室。

• 结构的比较
• 功能比较
• 纳米级的优点
• 如何使用纳米体工具箱
• 找到Nanobody质粒

结构比较

顾名思义，纳米体是更小的抗体。它们来源于一种不寻常的叫做a的IgG抗体重链抗体这是骆驼、大羊驼、羊驼和其他骆驼所特有的。就结构而言，hcab就像标准IgG的缩减版。下面是纳米体、HCab和传统IgG抗体结构的比较。

功能比较

强但大：抗体的优点

抗体是巨大间接免疫检测工具的主要原因之一是它们的强信号强度。该信号强度在很大程度上较大（〜10-15nm），这允许以下发生以下情况：

一)多个多克隆二级IgGs可以结合到一个一级抗体的不同表位。

B)抗体的每个臂具有每抗抗原结合位点，总共2个结合位点。

C)IgG足够大，每个抗体上都可以有多个标记(图2中的绿色圆圈)。

但规模大是一把双刃剑。抗体的大尺寸使目标抗原和荧光标记之间的距离更大，这可能会降低超分辨率荧光显微镜的图像分辨率。它们的大小也限制了它们穿透组织的能力。因为抗体是大的和二价的，一和二抗体不能一起孵育而不形成大的寡聚复合物。抗体也太大，不能在细菌中表达，这意味着它们的生产需要动物牺牲，并阻止了与报告酶的标记或融合的基因工程。

对于多色染色，在选择使用哪种抗体时必须仔细考虑。最好选择不同种类的一抗，或者至少是来自不同的IgG亚类，这样二抗只能识别一抗。这一过程可以避免直接使用抗体荧光团偶联，但这些通常比未偶联的一抗更昂贵。

小而强大:纳米体的优势

尽管抗体是免疫检测的钛，但纳米级可能更适合这项工作。作为单一结构域蛋白质，它们可以在细菌中表达，使纳米模型是重组和可再生的抗IgG试剂。它们的小尺寸也允许更好的组织穿透，并降低荧光标签和靶抗原至约2nm之间的距离，这可能导致超分辨率显微镜的较高分辨率。纳米级可用多达3个染料标记，产生与标准IgG二次抗体相似的信号强度（pleiner等，图4a-c）。由于它们在不同IgG亚类和不同物种之间具有有限的交叉反应性，因此纳米胚层可用于最多3个靶标的分层标记（Pleiner等，图4D）。

与大的二抗不同，小的纳米体在一起孵育时不会与一抗齐聚。在实验台上，这导致了一个更短的染色方案，因为一抗可以通过与标记的纳米体孵育而“标记”。在这个预孵育步骤之后，可以将第一抗体-纳米体混合物添加到样品中，从而消除第二抗体孵育。纳米体一步染色与抗体两步染色的比较见下面的图4A。

纳米级还简化了多色染色实验，因为它们不需要使用来自不同IgG亚类的主要抗体。相反，您可以用与所需荧光团缀合的次级纳米甲基酸预孵育个体初抗体。在下面的图4B中，即使具有三个IgG1抗体的染色细胞，也可以进行三倍的分致化。将抗体与与Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 647一起缀合的次级纳米型，在施加到样品之前。用这种多色染色工作流染色产生与一个靶标染色的细胞产生类似的定位模式（比较图4AVS 4B中的纳米尺寸染色）。

如何使用二级纳米体工具箱

你准备好开始在你自己的研究中使用纳米体了吗?太棒了!Pleiner等人通过免疫羊驼，从其血清中分离HCab抗体，以及精心筛选、优化和描述几种抗小鼠和-兔纳米体，为你做了艰苦的工作。如果你感兴趣，你可以了解更多关于纳米体是如何识别的这篇评论。如果你只是想使用Pleiner等人描述的纳米体，生成纳米体的关键步骤概述如下;不需要羊驼。

决定使用哪个Nanobody:

下表总结了Pleiner等人目前可用的纳米体。在选择二级纳米体之前，回顾一下一级抗体的一些特征是很重要的:它生长的种类和它的IgG亚类。一旦您知道了这两个问题的答案，请参考此表以找到适合您工作的纳米体。

在细菌中表达纳米曲面：

表2也有一个与质粒的链接，你需要在细菌中表达你所选择的纳米体。请注意，纳米体有1x和/或3x半胱氨酸品种。这是指纳米体可用于偶联到特定标签上的半胱氨酸位点的数量(更多信息见步骤4)。

用镍柱纯化纳米曲面：

Lyse表达纳米曲面的细菌并在镍柱上运行裂解物。由于其N末端HIS14-BDNEDD8标签，纳米级将与柱子结合。在几次洗涤之后，可以通过BDNedP1蛋白酶切割该标签，从而从柱中释放纯化的纳米级。BDNedP1蛋白酶可以使用质粒产生pDG02583。

标签Nanobodies:

然后用荧光染料或HRP通过马来酰亚胺标记纯化的纳米体。马来酰亚胺标记是指马来酰亚胺与巯基(-SH)形成共价键，如半胱氨酸中的巯基。马来酰亚胺偶联的辣根过氧化物酶在这里和几个马来酰亚胺共轭染料也可商购获得。

参考文献

1.Pleiner, T.， Bates, M.， & Görlich, D.(2017)。抗小鼠和抗兔IgG二级纳米体工具箱。细胞生物学杂志。PubMedPMID：29263082

• 从本出版物中发现质粒在Addgene。

2.Bates, M.， Böhning, m.i.， Chug, H.， Görlich, D.， Lee, C.， Pleiner, T.， Schliep, J.E.， Stark, H.， Trakhanov, S.， & Urlaub, H.(2015)。纳米体:用于超分辨率成像的位点特异性标记、快速表位定位和天然蛋白复合物分离。eLife。PubMedPMID：26633879pmed中央PMCID：PMC4755751

3.Muyldermans哔叽。"纳米体:天然单域抗体"生物化学年刊82(2013):775-97。PubMedPMID：23495938。

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额外的资源

寻找与次级纳米胸泡工具箱一起使用的单克隆原代抗体？看看NIH的发育研究杂交瘤银行（DSHB）。1ml含抗体的杂交瘤上清液仅为40美元，比商业上可获得的抗体明显便宜。