SunTag和荧光成像

由玛丽传动装置

在生物学中,生活中,往往更好。启动子中更多的转录因子结合位点导致较高的转录活化。多种核定位信号(NLS)增加蛋白质进入细胞核。在开发他们的时Suntag技术,淡水河谷斯曼实验室采取了这种生物课,并创建了一个系统以放大荧光信号。以“恒星爆炸超新星”命名的SunTag可以帮助你在荧光成像实验中提高亮度。

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荧光蛋白融合

追踪特定蛋白质最简单的方法之一是融化给荧光蛋白质。然后,您可以研究蛋白质的定位,以及其本地化和表达如何在各种条件下变化。但是,这个系统远非完美。例如,如果融合蛋白在低水平下表达,则必须增加您的成像时间以获得足够的信号。这种解决方法风险蜂窝光毒性,并消除了长期成像研究的可能性。如果您在更高的水平下过度表达蛋白质,则风险仅在蛋白质处于非常高的浓度时观察伪影。过表达蛋白也有潜力形成聚合物可能对细胞有毒。

SunTag来了

SunTag如何解决这些问题?而不是直接将荧光蛋白融入您的蛋白质,而不是将其融合到合成的Suntag脚手架上。该支架含有10-24份的短表位GCN4。GCN4募集与同源SCFV抗体融合的GFP,其从单独的质粒表达。该系统放大了荧光信号的强度,并使活细胞内的单分子跟踪在不影响蛋白质功能的情况下,从而产生细胞内方法的单分子报告。原来,Tanenbaum等观察到一些GFP聚集,它们通过使用小溶解度标签GB1使用超细粘合剂GFP(SFGFP)来降低。在整个博客文章的其余部分的Suntag命名中,GFP指的是SFGFP-GB1。
将传统的GFP融合蛋白与SunTag融合蛋白相比

Tanenbaum等人检测了SunTag对单分子成像的能力,发现以质膜为靶点的cax -SunTag比sfGFP亮18倍!高的SunTag信号使他们能够将激光功率削减80%以上,同时仍能以较低的光漂白率获得较高的信噪比。考虑到SunTag的强大功能,他们尝试在细胞核和细胞质中进行单分子成像。他们再次发现,SunTag非常有效地标记了单个分子——他们甚至成功地跟踪了运动蛋白驱动蛋白在微管中的运行长度。

Tanenbaum等人随后检验了他们的假设,即SunTag结构的低表达水平会避免对细胞生理的负面影响。发现线粒体追踪器GFP-mitoNEET可以损害线粒体功能后,他们检测了mitoNEET-SunTag-GFP的作用。正如预期的那样,他们获得了没有细胞器毒性的线粒体的明亮图像。

第一代(v1) SunTag表达量很低,这是由于GCN4支架稳定性差。为了增加表达量,Tanenbaum等人对GCN4序列进行了修饰,以增加其α -螺旋结构和稳定性,创建了v4 SunTag。由于v4系统不显示蛋白质聚集,它被推荐用于大多数成像应用。

你可以用圣塔格做什么?

Tanenbaum等人在他们的论文中进行了各种不同的实验,你也可以!在几乎任何情况下,你会使用一个传统的FP融合,一个SunTag融合也可以使用。

与传统荧光蛋白相比SunTag的优点伟德2021足球欧洲杯买球平台

  • 提高亮度和信噪比
  • 减少光毒性的几率
  • 降低了光漂白
  • 简化的,长期的单分子跟踪

Suntag的警告

  • 非常大的尺寸:一个完全被GFP占据的24倍支架的分子量为1400 kDa,而单独使用GFP的分子量为24 kDa。虽然传统的FP融合也会影响蛋白质活性、半衰期或定位,但SunTag对这些影响更大。
  • v1 SunTag表现出一些脚手架聚集(v4 SunTag没有)。

你可以根据不同的蛋白质来决定SunTag在你的实验中的适用性。然而,由于Addgene的许多SunTag质粒都觊觎“蓝色火焰”,显然该系统可以广泛应用于许多研究领域。除了荧光,SunTag也可以用来改善CRISPR-based激活目标基因,但我们要把这个应用留到以后!


参考

1.一种用于基因表达和荧光成像信号扩增的蛋白质标记系统。细胞159(3)(2014): 635 - 46所示。PubMedPMID: 25307933。公共医学中心PMCID: PMC4252608

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