质粒101:启动子区域-开始吧!

由肯德尔摩根

Plasmid_Map一旦你得到了解质粒是什么一般来说,是时候看看它的一些部分了。元素,如抗生素抗性基因起源的复制对于复制质粒是必要的,并确保细胞保持它。在这里,我们将涵盖启动子,这对于获得质粒表达我们感兴趣的基因是必要的。该元素负责将插入件的转录引起RNA。

在实践中,术语“启动子”描述了启动子(RNA聚合酶结合位点)和操作子(反应元件)的结合。启动子长约100到1000个碱基对,位于目标基因的上游。启动子区序列控件的绑定RNA聚合酶和转录因子,因此,促进剂在确定您的利益基因将被表达时发挥着重要作用。

RNA聚合酶(s)

RNA是用RNA聚合酶(RNAP)从DNA转录出来的。在细菌中,这是由一种酶完成的;然而,真核生物有多个聚合酶,每个聚合酶负责特定的rna子集。为了获得这种特异性,真核RNAP可以识别并结合特定的启动子元件。这意味着启动子在你的质粒骨干必须与需要进行的RNA的类型兼容:如果您希望mRNA(对于基因表达),您需要使用RNAP II启动子,而小RNA(例如shRNA)从RNAP III启动子转录。该帖子具有通用RNAP II和RNAP III转录的启动子;然而,使用病毒LTR作为RNAP II启动子通常在慢病毒和逆转录病毒构建体中使用,并且我们将在病毒载体部件的未来帖子中讨论这些。

启动子特异性

除了根据RNA转录物的类型选择推动者,您还需要确保您的质粒具有适合于宿主生物工作的启动子。因为转录机构在细胞类型或生物之间的不同之处,所以启动子必须是类似的变化。细菌启动子只在原核细胞中起作用,而且通常只在它们起源的相同或相近的物种中起作用。类似地,各种真核细胞类型(哺乳动物、酵母、植物等)需要独特的启动子,很少有交叉。一般来说,细菌中的促进剂不太多样化,复杂,零件少于真核细胞。有些促销员一直都是积极主动的,而另一些促销员则受到更仔细的控制。受调控的启动子可能只在特定的组织中或在发育的特定时期起作用,或者可能有办法通过化学、热或光随意打开或关闭它们。在细胞中,启动子本身还受到其他调节因素的控制:增强子、边界元件、绝缘体和消音器;然而,一些“漏”转录可能发生。对于细胞来说,这通常不是一个大问题,但如果你感兴趣的基因有毒,它可能会扰乱研究结果,甚至杀死你的细胞。为了对抗这一问题,科学家们创造了新技术YNITHETIC启动子,其通常包括其他启动子元素的某种组合,并且趋于更紧密地调节。

真核生物和原核生物的共同启动子

下面我们列出了两个参考表,列出了一些最常见的细菌和哺乳动物启动子。这些列表绝不是详尽无遗的,但当你尝试挑选完美的推广者时,应该是一个很好的起点!

真核生物启动子

启动子 主要用于 RNA转录 描述 表达 额外的注意事项
CMV. 一般表达式 信使核糖核酸 来自人类巨细胞病毒的强哺乳动物表达启动子 本构 可能包含一个增强器区域。在某些细胞类型中可以被抑制。
EF1a 一般表达式 信使核糖核酸 来自人类延伸因子1 α的强大哺乳动物表达 本构 倾向于给予一致的表达,不论细胞类型或生理。
SV40 一般表达式 信使核糖核酸 猴空泡病毒的哺乳动物表达启动子40 本构 可能包括一个增强器。
PGK1(人或小鼠) 一般表达式 信使核糖核酸 哺乳动物启动子的phosphoglycerate激酶基因。 本构 广泛表达,但可能因细胞类型而异。倾向于抵抗由于甲基化或去乙酰化引起的启动子下调调控。
UBC. 一般表达式 信使核糖核酸 来自人泛素C基因的哺乳动物启动子 本构 顾名思义,此启动子无处不在。
人类β-肌动蛋白 一般表达式 信使核糖核酸 哺乳动物启动子β肌动蛋白基因 本构 无处不在的。鸡肉型常用于启动子杂交种。
c 一般表达式 信使核糖核酸 强杂交哺乳动物启动子 本构 包含CMV增强子,鸡肌动蛋白启动子,兔球蛋白剪接受体。
tr 一般表达式 信使核糖核酸 四环素反应元件启动子 用四环素或其衍生物诱导的。 通常含有具有低基础活性的最小启动子和几种四环素算子。根据使用TET转移剂,可以打开或关闭转录。
uas. 一般表达式 信使核糖核酸 含有Gal4结合位点的果蝇启动子 具体的 需要Gal4基因的存在来激活启动子。
Ac5 一般表达式 信使核糖核酸 果蝇Actin 5c基因的强昆虫启动子 本构 常用于果蝇的表达系统中。
Polyhedrin 一般表达式 信使核糖核酸 来自Baculovirus的强昆虫启动子 本构 常用于昆虫细胞的表达系统。
Camkiia. 光遗传学的基因表达 信使核糖核酸 Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II启动子 具体的 用于神经元/中枢神经系统表达。由钙和钙调蛋白调节。
GAL1 10 一般表达式 信使核糖核酸 酵母菌相邻,分散转录的启动子 与半乳糖诱导;与葡萄糖阻遏 可单独使用或一起使用。由GAL4和gal80调控。
TEF1 一般表达式 信使核糖核酸 酵母转录伸长因子启动子 本构 类似于哺乳动物的EF1a启动子。
GDS. 一般表达式 信使核糖核酸 来自甘油醛3-磷蔗糖脱氢酶的强酵母表达启动子 本构 非常强,也叫TDH3或GAPDH。
ADH1 一般表达式 信使核糖核酸 酒精脱氢酶I酵母启动子 压抑的乙醇 全长版本具有高表达式。截短的启动子是组成型,表达下降。
CaMV35S 一般表达式 信使核糖核酸 来自花椰菜马赛克病毒的强植物启动子 本构 在单萝卜中活跃,在单焦点中活跃,在动物细胞中有一些活性。
UBI. 一般表达式 信使核糖核酸 来自玉米泛素基因的植物启动子 本构 在植物中高表达。
H1 小RNA表达 Shrna. 来自人聚合酶III RNA启动子 本构 可能比U6表达略低。可以在神经元细胞中具有更好的表达。
U6 小RNA表达 Shrna. 来自人类的U6小核启动子 本构 小鼠U6也被使用,但可能效率较低。

原核促进剂

启动子 主要用于 描述 表达 额外的注意事项
T7 体外转录/一般表达 T7噬菌体启动子 构成,但需要T7 RNA聚合酶。 当用于体外转录时,启动子驱动意义或反义转录,这取决于它对你的基因的方向。
T7lac 高水平的基因表达 来自T7噬菌体Plus Lac算子的启动子 不诱导时可忽略基础表达。需要T7 RNA聚合酶,也由lac操作符控制。可被IPTG诱导。 通常在pET载体中发现。V密码算子紧密调控。善于通过各种诱导浓度调节基因表达。
SP6. 体外转录/一般表达 Sp6噬菌体启动子 构成,但需要SP6 RNA聚合酶。 SP6聚合酶具有高的加工率。用过的时候或体外转录,启动子根据其对基因的方向驱动意义或反义转录物。
araBAD 一般表达式 阿拉伯糖代谢操纵子启动子 阿拉伯糖和压抑诱导分解代谢物的抑制存在的葡萄糖或竞争性结合的反诱导焦点 弱。通常在pBAD载体中发现。有利于快速调节和低基础表达;但是,不适合通过各种诱导浓度调节基因表达。
TRP. 高水平的基因表达 大肠杆菌色氨酸操纵子的启动子 可抑制的 因为细胞色氨酸含量过高而失去兴趣。
Lac. 一般表达式 Lac Operon的推动者 缺失lac阻遏物(lacI或lacIq)构成的。可由IPTG或乳糖诱导。 带有s的漏的启动子omewhat弱表达。LACIQ突变增加阻遏物10X的表达,从而拧紧LAC启动子的调节。善于通过各种诱导浓度调节基因表达。
PTAC. 一般表达式 紫胶和色氨酸杂交启动子 像紫胶酶启动子一样受调控 包含trpB中的-35 region和lac中的-10 region。非常紧密的监管。善于通过各种诱导浓度调节基因表达。一般优于单独紫胶。
pL 高水平的基因表达 来自噬菌体λ的启动子 温度可以调节吗 通常与温度敏感的cI857阻阻器配对。
T3 体外转录/一般表达 T3噬菌体启动子 组成型,但需要T3 RNA聚合酶 当用于体外转录时,促进剂根据其对基因的定向驱动意义或反义转录物

虽然这个列表是一个很好的起点,但上面的表格并没有深入研究科学家可用的组织或发育特异性促进剂。质粒通常用于治疗,正如NIH研究人员所描述的,在这种情况下,识别正确的组织特异性启动子是很重要的在这里


注:A. Max Juchheim对本文的写作有贡献。

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