质粒101:Topo Cloning

由Lianna Swanson.

基于拓扑异构酶的克隆(Topo Cloning)是DNA克隆方法不使用限制酶或者搭配,不需要PCR后程序。听起来很容易吗?该技术依赖于互补碱腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)杂交和形成氢键的基本能力。这篇文章侧重于“粘性结束”Topo(也称为Topo-Ta)克隆;然而,Topo克隆技术也适用于钝端克隆。

那么Topo克隆工作如何?

如下图所示,蓝色PCR产物插入物上的“A”突出来自使用Taq聚合酶进行扩增步骤,因为Taq聚合酶在PCR产物的3'末端留下单一的脱氧腺苷(A)。该对中的互补“T”来自拓扑异构酶I线性化骨架。DNA拓扑异构酶I(描绘为绿色云)作为限制性内切核酸酶和作为连接酶的粘合,通过切割和加强超底DNA末端以促进复制。

Topo Cloning Vector.TOPO技术特异性使用痘苗病毒 - 分离的拓扑异构酶I,因为该酶识别DNA序列5'-(C / T)CCTT-3'并在该序列上消化双链DNA。从该破裂的能量被储存为切割的3'DNA链和拓扑异构酶I的酪氨酸残基之间的共价键(1)。如果来自来自不同DNA链的5'羟基出现,它可以攻击该共价键,从而连接两个DNA链并释放拓扑异构酶(2)。

这些天商业上可获得的Topo套件提供载体或克隆臂,其具有悬垂的3'脱氧(T)残留物,其与拓扑异构酶共价连接。这些套件中的载体通常也使拓扑异构酶位点插入β-半乳糖苷酶盒中,允许研究人员进行蓝白筛选转型- 载体的自我加入结束导致生产不需要挑选的蓝色菌落测序对于潜在的阳性克隆。一旦您介绍了3'-End“A”突出插入后,Topo Cloning的魔力就会发生。

基本程序

让我们分解Topo Cloning所需的步骤:

1.创建PCR产品:设计标准引物(无需在两端添加独特的限制性点),并使用您最喜欢的PCR协议扩增您对Taq聚合酶的感兴趣顺序。

2.设置Topo Cloning反应:将PCR产物和Topo载体混合在一起。

3.在室温下孵育5分钟:如果您计划立即转换,您可以将反应放在冰上,或者您可以在-20c过夜存储反应。

4.将Topo Cloning反应转化为能量细胞:您可以使用标准实验室协议;但是,您应该将灌注时间减少到冰上为5分钟(孵育完整30分钟不会显着提高转化效率)。

5.选择和分析10白色或浅蓝色殖民地您可以通过PCR确认您的插入物,限制性摘要,或者测序

专业提示

  • 不要将5'磷酸盐添加到PCR引物;您需要免费羟基!
  • 您可能希望在PCR的最后一个循环后包含额外的延长时间,以确保添加到所有PCR产品中的“A”。
  • 请记住,Taq聚合酶的错误率为3,500个碱基。通常使用具有校对功能的聚合酶代替TAQ以降低误差速率;然而,校对聚合酶也将在PCR产物中除去所有未配对的3'末端。如果您需要减少错误率,请使用其中一种方法来确保您的插入保留3'A悬垂:
    • 使用校对酶和Taq的混合物,Taq以10:1的过量比率使用。
    • 凝胶净化您的PCR产品并在72℃下用缓冲液,Taq和Datps孵育10-15min。
  • 将PCR产品与Topo Vector混合时,您可能想要向您的反应添加额外的盐:

当PCR产物和载体Liate时,从载体中释放拓扑异构酶。然而,它可能会突出并缩小新连接的DNA。盐有助于防止拓扑异构酶I从重新绑定,这导致更完整的分子。(请注意,您添加的盐量将取决于您是否正在计划将反应转化为化学或电力大肠杆菌 -过量的盐在电穿孔期间导致电弧导致电穿孔失败)。

  • 在室温下孵育时,不建议您超过5分钟的时间限制(较长的转化效率随着较长的孵化);但是,如果PCR产品处于低浓度,或者您克隆了极大的插入物,您可能需要孵育20-30分钟。
  • 由于标准连接反应相当快,确保您在进行之前持续组织并准备下一步所需的一切。
  • 在电镀之前预先加热含抗生素的板可以让您在8小时内看到殖民地。

参考:

1. Shuman S.“通过疫苗病毒DNA TOPOISOMERASE I介导的重组在大肠杆菌中介导的序列特异性。”Proc Natl Acad Sci U S A.1991年11月15日; 88(22):10104-8。PubMed.PMID:1658796.。pmed中央PMCID:PMC52876.

2.使用痘苗DNA拓扑异构酶的分子克隆和多核苷酸合成的新方法。舒曼S.J Biol Chem。1994年12月23日; 269(51):32678-84。PubMed.PMID:7798275

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

addgene.org的资源

点击下载addgene的质粒101电子书

话题:质粒101.质粒克隆质粒

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅