伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:亚细胞结构和细胞器的可视化

由Susanna Bachle.

与器官组成的人体相同的方式,细胞包括隔室和结构,称为细胞器。在细胞内拍摄潜行峰值艾伦细胞探索者号传回的图像1).

当研究蛋白质的功能或其在疾病中的作用时,研究人员通常分离感兴趣的蛋白质,并使用生化方法检查它们,从而去除细胞的环境。然而,通过了解蛋白质在活细胞中的位置和运输,可以获得许多关于功能的知识。分析健康状态和疾病状态之间蛋白质定位和转运的差异也可以为了解疾病机制和蛋白质功能提供有趣的见解。

下载荧光蛋白101电子书伟德2021足球欧洲杯买球平台

准备好确定你感兴趣的蛋白质的亚细胞定位

分析您感兴趣的蛋白质本地化的第一步是使其可检测到。可以使用荧光显微镜可视化 - 即使在活细胞和整个生物中也可以实现。您可以利用可用于显微镜的许多荧光蛋白(FP),通过克隆您的感兴趣的蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台质编码荧光标记的载体.一旦表达为荧光蛋白融合,可以从其生产现场跟踪您的利益蛋白质到最终目的地。作为一个例子,大多数分泌的蛋白质在内质子网中产生,在GOLGI中改性,然后通过分泌途径在亚细胞或细胞外目的地中在囊泡中运输。在其生命周期结束时,蛋白质可以通过囊泡输送到溶酶体,在那里它们最终降解(23.).

一旦创造了融合蛋白,重要的是验证其相对于未标记的野生型蛋白质的功能。例如,您可以通过将来自融合本身的信号与荧光标记的抗体观察的野生型蛋白质比较来验证融合蛋白定位的融合蛋白定位。

通过使用已知是细胞器的一部分或参与细胞内传输途径的“标记蛋白”,可以映射细胞的内部组织。这种映射可以通过使用靶向标记蛋白的抗体来完成,但是,在这种情况下,需要固定细胞,并且透透抗体以使抗体达到其细胞内靶标的细胞膜。因此,采用标记为FPS的良好表征标记蛋白质可以是有益的,以突出各种亚细胞结构。请参见图1主要哺乳动物细胞器和运输途径的常用标记物

最好的,尽管并非总是可以使用惰性荧光蛋白融合来可视化亚细胞结构。例如,您可以使用融合到将荧光蛋白的信号序列融合给您感兴趣的荧光蛋白的荧光蛋白。

点击下图中的基因名称可以找到含有该特定基因的质粒。

特定蛋白质的亚细胞定位

酵母的亚细胞标记见我们的质粒收集Sue Jaspersen.(家具学院)和马克·普雷斯科特(蒙纳士大学)。

您可以找到更多的质粒,用于标记您的亚细胞结构的毛细胞艾伦细胞科学研究所质粒收集.你也可以使用全长斑马鱼褐土蛋白库从Rob Parton的实验室(昆士兰大学)观察膜贩运活动体内。

定位你的蛋白质,通过共定位看看它和谁在一起——也就是“它们很近吗?”

在标记蛋白质和选择的亚细胞标记蛋白质后,可以了解亚细胞结构的想法,您的蛋白质存在于其形成复合物中的其他蛋白质。这些“分封体化”研究就相同亚细胞结构或蛋白质复合物内的两种蛋白质的附近提供了见解。通过共表入标记蛋白和感兴趣的蛋白质,然后分析它们的荧光信号的相对分致化和电位重叠,可以确定复杂结构中蛋白质的位置。

为了科学而有意义地解释同质化实验,选择合适的量化方法和工具是很重要的。通过简单的“看”,用主观判断来检查你的图像通常是不够的。现代相机和图像分析软件对检测人眼不可见的光信号高度敏感,对主观色彩强度感知无关紧要。开源图像分析软件工具可以用于共定位分析。一些例子包括ImageJp林林JACoPCOLOC 2bioimagexd.,并定制CellProfiler管道。图像分析软件产生可量化的结果和统计数据,可用于不同实验设置之间的比较。

在图2中给出了分层分析例(调整4) -Dunn等人。2011年提供了对定量分层化分析方法和有用的图像分析软件工具的深入综述。

显微镜下亚细胞共定位

陷阱、限制和专门的同域化方法

伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白是非常有用的工具,但它们并非没有局限性,并且执行良好的实验需要对FP特性的一些考虑。当心是很重要的与荧光成像相关的一般问题例如漏泄(在不同的荧光信号的通道设置中错误地检测到一个荧光信号)和光漂白即FP稳定性。

还应意识到与FPS本身的属性有关的其他问题。这些可以包括寡发的可能性,蛋白质电荷和实际分子尺寸 - 可以改变大型或带电的FP融合可以改变感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。科学家们不断更新和优化FP工具以避免这些问题。例如,参见最近开发的FPs针对不同的蜂窝环境进行了优化

由于分开的依赖于检测2个独立荧光信号及其潜在重叠,因此必须确保所选择的FPS不会彼此影响,因此可能伪造信号。作为基线规则,选择所选FPS的发射光谱需要充分分离,最常见的是具有红色和绿色波长的FPS(6).这些之前的博客文章帮助您使用哪个FP的决定以及如何选择FPs进行多色成像

此外,必须记住,光学显微镜的分辨率受到光波长的限制,并且实际上是普通实验室显微镜的检测限为200nm。大多数蛋白质的大小低于10nm,因此在显微镜下检测到的分致化不能被解释为直接分子相互作用而无需进一步调查。一种通常用于分析两种分子之间相互作用的一种荧光显微镜方法,更紧密是Förster共振能量转移,烦恼

其他机会:追踪细胞内病原体

除了跟踪蛋白质的位置,也可以跟踪病毒和细胞内细菌的生命周期,看看我们的微生物学资源用于荧光标记的病毒和细菌组分。例如,马里埃特·巴比尔实验室的彩虹向量可用于荧光标记各种各样的革兰氏阴性细菌(西弗吉尼亚大学医学院7).

确定亚细胞定位和细胞复合物的组成是了解你的蛋白质在健康或患病细胞的功能的重要步骤。我们希望本文中讨论的资源对您的下一个本地化实验有用,并邀请您将您在自己的工作中创建的任何荧光蛋白结构提供给Addgene社区。

下载我们这里的亚细胞本地化海报的标记!


参考

1.艾伦研究所质粒页面

2. Cooper Gm。2000年。细胞:分子方法。第2版

3. cureffi.org。细胞生物学04:分泌途径

4.Dunn,Kenneth W.,Malgorzata M. Kamocka和John H. Mcdonald。“在生物显微镜中评估分层化的实用指南。”美国生理细胞生理学杂志300.4 (2011): C723-C742。PubMedPMID: 21209361.公共医学中心PMCID:PMC3074624

5.Bindels,Daphne S.等人。“Mscarlet:用于细胞成像的明亮单体红色荧光蛋白。”自然方法14.1(2017): 53-56。PubMedPMID:27869816

6.媒体网络网络。荧光探针的共定位

7.Barbier, Mariette和F. Heath Damron。广谱细菌荧光标记彩虹载体《公共科学图书馆•综合》11.3 (2016): e0146827。PubMedPMID: 26937640.公共医学中心PMCID:PMC4777285

进一步的阅读

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

addgene.org的资源

主题:伟德2021足球欧洲杯买球平台伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101

发表评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅