汇集CRISPR图书馆为大型功能屏幕提供基因组控制

由肯德尔摩根

CRISPR技术改变了科学家如何编辑和控制基因,而是根据广泛的研究所的Silvana Konermann,第一代CRAP-CAS9质粒并没有设计基因活化。“我们没有设法创建一个系统,以便我们基本上可靠地激活任何基因,”她说。从突变和取消激活基因或基因以选择性地激活它们的技术飞跃是一个大的。那个对她的问题是这样的:你能在任何基因上工程如何处理足够好的基因的CRISPR-CAS9激活因素,以至于他们可以用小企业工程专业知识的人员使用?

“这是高吞吐量,基因组筛选的下一步,”Konermann说。“如果您想激活所有20,000个基因,则无法测试每个基因并确保其工作。您只能使用系统执行该屏幕,您对大多数基因和个人定位模块工作非常有信心。在我看来,这两件事尚未实现。“直到现在。

输入SAM池库


协同激活介质(SAM)复合物汇集CRISPR文库的示意图。该系统用于CRISPR基因激活。SAM综合体由三个组分组成:1)非活性CAS9-VP64融合,2)SGRNA,其包含两个MS2 RNA适体,3)激活辅助蛋白,其由三个不同的活化结构域-VP64,P65和HSF1组成。这些组分在一起靶向基因组中的特定部位的鲁棒转录激活复合物。在发表的论文中自然12月,康曼和她的同事在张张的实验室只是这样的系统,他们称之为CRISPR / CAS9协同激活调解员或山姆。SAM是一种用于内源基因的转录激活的工程蛋白质复合物,它包括三种组分:

1.一种核酸不活性的Cas9-VP64融合;

2.在图级和茎环2处包含两个MS2 RNA适体的SGRNA;

3.表达活化辅助蛋白的MS2-P65-HSF1质粒。

SAM可以与人类基因组宽的库组合,以激活来自Refseq数据库的所有23,430名已知的编码同种型。开发新系统Konermann解释的关键是关于CAS9的晶体结构的新知识。

“我想也许我们可以使用结构中的信息来指导和改进激活器设计,”她说。“在黑暗中有点像攻丝 - 很多试验和错误。”

结构细节揭示了两个暴露的RNA环,Konermann被认为是融合活化剂而不是在蛋白质的C末端融合的理想点。随着这种新设计,Konermann立即看到了激活的数量级,并知道她在正确的轨道上。

下一个洞察力是组装由多个不同的效应域组成的合成转录激活复合体,该域同样在一起,在自然转录激活过程之后建模。Konermann和她的同事通过筛选基因来展示新系统,即在开启时,使黑色素瘤细胞用BRAF抑制剂进行治疗。(测试是一个完美的补充先前进行由张实验室为壁虎,一种慢病毒Crisprpress,可以实现基因组级,敲除筛选)。

作为张实验室的自然纸报报告称,“我们已经表明,SAM系统具有坚固的,具体,并且可以促进与紧凑型SGRNA库相结合的基因组级功能筛选。我们的SAM介导的屏幕具有高度一致性和验证,每种基因有效富集引导率,并验证前10个点击。“

双向Crispr筛选

在十月,乔纳森威斯曼实验室额外推出汇集CRISPR图书馆,也可在Addgene中获得,使系统调查抑制或诱导个体转录物的细胞后果。活化剂(CRISPRA)SGRNA库使用SUNCAS9系统,并为每种转录的10个SGRNA在15,977个人基因中开始。转录阻遏物(CRISPRI)文库含有10个转录的SGRNA,用于每种转录在那些15,977个人基因中的开始位点。

Weissman和他的同事在一篇论文中展示了细胞它们通常可以达到90-99%的敲低,以最小的偏差效应。该系统还使它们能够在基因组中的任何位置接通基因控制范围内的基因控制。

Weissman解释说,系统中有两个级别的控制。首先,CAS9可以打开和关闭,以可逆地激活或抑制感兴趣的基因。他们还“表明不同的指南RNA具有不同的能力来打开和关闭基因,”他说。“有些人很强壮,更温和;有一种等位基因系列,基因导通和关闭的程度根据我们使用的指导RNA而变化。我们现在要做的是更多地了解规则。“

他说,在一次可以操纵的基因数量没有理论限制。Weissman的集团已提供标准协议,他们正在努力进一步优化那些。它们还开发SGRNA,可以更加微调基因表达水平和用于分析数据的软件。

应用新图书馆以用于各种细胞类型和实时小鼠,应该是直接的。人类的治疗用途也在桌子上。

“在未来,有潜力,”他说。“我们必须优化我们如何提供这些工具,因为显然,与鼠标不同,我们不能依赖基因工程来优化Crispri和Crispra的人类。”


在考虑在实验中使用汇总图书馆之前,Addgene建议您评论如何使用汇集的慢病毒CRISPR库的步骤并记住以下内容:

  • 汇集了这些库。这些可以使用库完成的大多数屏幕都需要访问下一代测序技术。
  • 这些库本质上是慢病毒,因此请确保您配备和授权制作和使用Lentivirus。另外,注意,由于骨干的尺寸,变换需要电穿孔。

对CRISPL池库的库感兴趣?点击这里在addgene找到它们


参考和进一步阅读:

有关SAM的更多信息包括用于对激活任何人类基因进行优化指导序列的工具,转到http://sam.genome-ennineering.org/

水晶结构Cas9.在与引导RNA和靶DNA的复合物中。Nishimasu H,RAN FA,HSU PD,konermann.S,Shehata Si,Dohmae N,Ishitani R,Zhang F,Nureki O. Cell。2014年2月27日; 156(5):935-49。DOI:10.1016 / J.Cell.2014.02.001。EPUB 2014年2月13日。

通过工程卷曲的基因组转录激活 -Cas9.复杂的。konermann.S,Brigham MD,Trevino Ae,Joung J,Abudayyeh Oo,Barcena C,Hsu Pd,Habib N,Gootenberg JS,Nishimasu H,Nureki O,Zhang F.自然。2015年1月29日; 517(7536):583-8。DOI:10.1038 / Nature14136。EPUB 2014 DEC 10。

基因组规模克里普尔克介断对基因抑制和活化的控制。Gilbert La,Horlbeck Ma,Adamson B,Villalta Je,Chen Y,Whitehead EH,Guimaraes C,Panning B,Ploegh HL,Bassik Mc,Qi Ls,Kampmann M,韦斯曼JS。细胞。2014年10月23日; 159(3):647-61。DOI:10.1016 / J.Cell.2014.09.029。EPUB 2014年10月9日。


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