Prime编辑:为CRISPR编辑添加精度和灵活性

由詹妮云顶娱乐 韦德国际弗曾

2020年6月5日更新。

有超过75,000种致病性遗传变异,已在人类中鉴定并在其中录制Clinvar数据库。之前开发的基因组编辑方法使用核酸酶和基础编辑器有可能在大多数细胞类型中纠正这些变体的少数群体。一种新技术大卫刘的实验室在广泛的研究所可以增加更多的精确度和灵活性CRISPR编辑世界。

'编辑概述

这个新方法,发表于自然界本周早些时候称为Prime编辑。这是一个“搜索和替换”基因组编辑技术,调解有针对性的插入,删除和所有可能的基本到基础转换。并且,它可以将不同类型的编辑彼此组合。所有这一切都是可能的,没有双链断裂(DSB)或供体DNA模板。这是如何工作的呢?首先,一个既指定目标位点又包含所需编辑的工程引编辑引导RNA (pegRNA)与引编辑蛋白结合。该引物编辑蛋白由一个Cas9 nickase融合到一个逆转录酶。该蛋白的Cas9 nickase部分被pegRNA引导到DNA靶位点。Cas9切割后,逆转录酶结构域使用pegRNA模板进行所需编辑的逆转录,直接将DNA聚合到切割的目标DNA链上。经过编辑的DNA链取代了原来的DNA链,创造了一个包含一条经过编辑的链和一条未经编辑的链的异源双工。最后,编辑器指导异构双工的解析,以有利于将编辑的内容复制到未编辑的链上,完成这个过程。

让我们更详细地检查零件。

Prime编辑器:Cas9和逆转录酶之间的融合

减少组件的素数编辑会引入细胞中,该团队将M-MLV逆转录酶(RT)融合在一起CAS9 H840A Nickase.创建PRIME编辑器(PE)。他们发现定向事项:将RT融合到Cas9切口酶的C末端导致更高的编辑效率。他们叫这个综合体PE1.

在前逆转录酶研究时建立(Baranauskas等人,2012年;Arezi和Hogrefe, 2009),刘实验室创建和评估了19个PE1变体,其中RT突变已知增加活性,增强模板和引物结合位点之间的结合,提高处理率或提高热稳定性。什么出现在上面?Cas9酸氨酸酶融合到M-MLV RT的五醇。他们叫这个系统PE2与PE1相比,PE1在不同的基因组位点上的启动子编辑效率平均提高了2.3- 5.1倍(但最高可达45倍)。

pegRNA:一个模板和指南在一个

Prime编辑的其他重要组成部分是Prime编辑指南RNA(PEGRNA)。PEGRNA是指编码RT模板的引导RNA,其包括对基因组DNA基因座的所需编辑和同源性。对切​​屑基因组DNA链互补的序列用作底漆结合位点(PBS)。该PBS序列与靶位点杂交并用作逆转录的启动点。

为了优化PEGRNA,该团队发现将PEGRNA引物结合位点扩展为至少八个核苷酸,使HEK293T细胞中的更有效的素质编辑能够。

Phime编辑Pegrna Complex

为了设计pegRNAs, Liu实验室创建了PrimerDesign这是一个主要的编辑设计工具,还有Pinello实验室和jung实验室。

主编辑3 (PE3):解析不匹配的DNA以有利于编辑

一旦主编辑器将编辑的序列整合到一条链中,一条链上的原始序列和另一条链上的编辑序列之间就会出现不匹配。为了引导异源双工分辨率有利于编辑,刘实验室转向了一种策略以前在开发基编辑时使用(Komor等,2016)。通过切断未编辑的链,它们可以使细胞用编辑过的链作为模板重新构建那条链。

通过包括额外的SGRNA,称为PE3的第三个PRIME编辑系统。使用此SGRNA,Prime编辑器刻录未经编辑的股线,远离初始缺口部位(以避免产生双链断裂),增加编辑效率2-3折,indel频率在1-10%之间。

找到主要编辑质粒!

注意:PE2,PE3和PE3B都使用PE2(PCMV-PE2)。PE3和PE3B添加SGRNA,可以是任何导向RNA表达载体或盒式磁带

素质编辑的优势

不受PAM序列位置的约束

主编辑器扩展了CRISPR基因组编辑的范围,因为它可以编辑PAM附近或远离PAM的位点,使其不像其他方法那样受到PAM可用性的限制。对于主要编辑,pam到编辑的距离可以超过30个碱基对。由于PAM位点在任何一条DNA链上每~8个碱基对就出现一次,因此有许多以前开发的基础编辑器(表1来自REES和LIU,2019)使用<8个基础对编辑窗口无法编辑Fyodor Urnov指基因组中的“PAM沙漠”。

比基本编辑更通用,精确(在某些情况下)

到目前为止开发的基础编辑器只能创建更改的子集(C-> T,G-> A,A-> G和T-> C)。Prime编辑允许所有12个可能的基础变化。

Prime编辑也更加精确。例如,碱基编辑器将在碱基编辑窗口中编辑所有的C或A,而主编辑器进行pegRNA定义的特定编辑。在无法接受旁观者编辑的情况下,可以使用主编辑器来避免这种可能性。

然而,在某些情况下,传统的基本编辑器是首选的。例如,如果目标核苷酸位于规范碱基编辑窗口内,则碱基编辑具有更高的效率和更少的indels。但是对于编辑窗口中没有很好地定位的位置,主要编辑由于对PAM位置的依赖性较低,因此效率更高。

与同源定向修复相比,副产物更少,效率更高

同源性定向修复HDR (HDR)是一种由双链断裂刺激产生精确变化的技术。然而,Cas9裂解的效率相对较高,而HDR的效率相对较低,意味着大多数Cas9诱导的DSB都是由异源端加入。结果,Cas9治疗导致大多数产品是诱导的,而HDR的效率通常小于10%。相比之下,PRIME编辑可以在HEK293T细胞中提供〜20-50%,1-10%的indels。在其他测试细胞类型中,包括多肽后小鼠皮质神经元,提交人报告了较低的素质编辑效率,但仍然看到比Cas9发起的HDR indel副产物的所需编辑比较高的比例。

素质编辑的接下来是什么?

虽然初始编辑是迈向更多功能基因组编辑的令人兴奋的一步,但在这一点上它是新的,并保证了许多额外的研究。在他们的论文中,Liu实验室指出,需要以全基因组的方式调查偏离目标的启动编辑,确定启动编辑器可能对细胞产生的任何意外影响,并进行评估在体外体内交付策略。看到Twitter上大量关于prime编辑的讨论(在这里在这里,在这里)我们期待着看到Prime编辑的接下来是什么。

从David Liu的实验室找到质粒!


参考文献

Anzalone, Andrew V.等。“无需双链断裂或供体DNA,就能进行基因组搜索和替换编辑。”自然(2019):1-1。PubMed.PMID: 31634902

Arezi Bahram和Holly Hogrefe。Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶的新突变通过与模板引物更紧密的结合增加了热稳定性。核酸研究37.2(2008):473-481。PubMed.PMID: 19056821。pmed中央PMCID:PMC2632894

Baranauskas,Aurimas等。“新型高温和加工M-Mulv逆转录酶变体的生成和表征。”蛋白质工程,设计和选择25.10(2012):657-668。PubMed.PMID: 22691702

Komor, Alexis C,等。"基因组DNA中目标碱基的可编程编辑不需要双链DNA裂解"自然533.7603(2016): 420。PubMed.PMID: 27096365。pmed中央PMCID: PMC4873371

Rees, Holly A.和David R. Liu。碱基编辑:活细胞基因组和转录组的精确化学。《自然评论遗传学》19.12(2018):770-788。PubMed.PMID: 30323312。pmed中央PMCID: PMC6535181

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

在Addgene.org上的资源

话题:CRISPR中科院的蛋白质CRISPR gRNAs基础编辑

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅