初级编辑:为CRISPR编辑添加精度和灵活性

由詹妮云顶娱乐 韦德国际弗曾

2020年6月5日更新。

有超过75000个致病基因变异已经在人类中被鉴定出来并在ClinVar数据库。之前开发的基因组编辑方法使用核酸酶和基本编辑有可能纠正大多数细胞类型中的少数变异。一项新技术大卫刘的实验室在布罗德研究所可以增加更多的精确度和灵活性CRISPR编辑世界。

'编辑概述

这个新方法,发表在《自然本周早些时候,被称为prime editing。它是一种“搜索和替换”的基因组编辑技术,可以调节目标插入、删除和所有可能的碱基到碱基转换。而且,它可以组合不同类型的编辑彼此。所有这些都可以在没有双链断裂(DSBs)或供体DNA模板的情况下实现。这是如何工作的呢?首先,一个既指定目标位点又包含所需编辑的工程引编辑引导RNA (pegRNA)与引编辑蛋白结合。该引物编辑蛋白由一个Cas9 nickase融合到一个逆转录酶。该蛋白的Cas9 nickase部分被pegRNA引导到DNA靶位点。Cas9切割后,逆转录酶结构域使用pegRNA模板进行所需编辑的逆转录,直接将DNA聚合到切割的目标DNA链上。经过编辑的DNA链取代了原来的DNA链,创造了一个包含一条经过编辑的链和一条未经编辑的链的异源双工。最后,编辑器指导异构双工的解析,以有利于将编辑的内容复制到未编辑的链上,完成这个过程。

让我们更详细地检查零件。

主要编辑:Cas9和逆转录酶的融合

为了减少初级编辑将引入细胞的成分,研究小组将M-MLV逆转录酶(RT)与Cas9 H840A nickase创建主编辑器(PE)。他们发现取向很重要:将RT融合到Cas9镍酶的c端会产生更高的编辑效率。他们称这个复合体为PE1

基于先前的逆转录酶研究,(Baranauskas等人,2012年;Arezi和Hogrefe, 2009), Liu实验室创建并评估了19个已知的RT突变的PE1变体,这些RT突变可以增加活性,增强模板和引物结合位点之间的结合,增加processivity,或提高热稳定性。最上面是什么?Cas9镍酶与M-MLV rt的五突变体融合,他们称之为这个系统PE2与PE1相比,PE1在不同的基因组位点上的启动子编辑效率平均提高了2.3- 5.1倍(但最高可达45倍)。

pegRNA:一个模板和指南在一个

启动编辑的另一个重要组成部分是启动编辑引导RNA (prime editing guide RNA, pegRNA)。pegRNA是一个引导RNA,也编码RT模板,其中包括所需的编辑和同源到基因组DNA位点。序列互补的缺口基因组DNA链作为引物结合位点(PBS)。该PBS序列与靶位点杂交,作为反转录起始点。

为了优化pegRNAs,研究小组发现,将pegRNA引物结合位点扩展到至少8个核苷酸,可以在HEK293T细胞中更有效地编辑引物。

主要编辑器pegRNA复合体

为了设计pegRNAs, Liu实验室创建了PrimerDesign这是一个主要的编辑设计工具,还有Pinello实验室和jung实验室。

主编辑3 (PE3):解析不匹配的DNA以有利于编辑

一旦主编辑器将编辑的序列整合到一条链中,一条链上的原始序列和另一条链上的编辑序列之间就会出现不匹配。为了引导异源双工分辨率有利于编辑,刘实验室转向了一种策略以前在开发基编辑时使用(Komor等,2016)。通过切断未编辑的链,它们可以使细胞用编辑过的链作为模板重新构建那条链。

名为PE3的第三个prime编辑系统通过包含一个额外的sgRNA来做到这一点。使用这种sgRNA,主编辑器将未编辑的链切离初始缺口位置(以避免产生双链断裂),在indel频率在1-10%之间的情况下,编辑效率提高了2-3倍。

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注:PE2、PE3、PE3b均使用PE2 (pCMV-PE2)。PE3和PE3b添加sgRNA, sgRNA可以是任何引导RNA表达载体或盒

初级编辑的优点

较少受PAM序列位置的限制

主编辑器扩展了CRISPR基因组编辑的范围,因为它可以编辑PAM附近或远离PAM的位点,使其不像其他方法那样受到PAM可用性的限制。对于主要编辑,pam到编辑的距离可以超过30个碱基对。由于PAM位点在任何一条DNA链上每~8个碱基对就出现一次,因此有许多以前开发的基础编辑器(来自Rees和Liu的表1,2019)具有<8碱基对编辑窗口的基因组中Fyodor Urnov所称的“PAM沙漠”不能编辑。

比碱基编辑更灵活和精确(在某些情况下)

迄今为止开发的碱基编辑器只能创建更改的子集(C->T, G-> a, a ->G,和T->C)。基本编辑允许所有12种可能的基础到基础的变化。

Prime编辑也更加精确。例如,碱基编辑器将在碱基编辑窗口中编辑所有的C或A,而主编辑器进行pegRNA定义的特定编辑。在无法接受旁观者编辑的情况下,可以使用主编辑器来避免这种可能性。

然而,在某些情况下,传统的基本编辑器是首选的。例如,如果目标核苷酸位于规范碱基编辑窗口内,则碱基编辑具有更高的效率和更少的indels。但是对于编辑窗口中没有很好地定位的位置,主要编辑由于对PAM位置的依赖性较低,因此效率更高。

与同源定向修复相比,副产物更少,效率更高

同源性定向修复HDR (HDR)是一种由双链断裂刺激产生精确变化的技术。然而,Cas9的解理效率较高,而HDR的解理效率较低,这意味着大多数cas9诱导的dsb是由异源端加入。因此,Cas9处理导致大多数产品是indels,而HDR的效率通常低于10%。相比之下,在HEK293T细胞中,初级编辑可以提供~20-50%的效率,1-10%的indels。在其他测试的细胞类型中,包括有丝分裂后的初级小鼠皮层神经元,作者报告了较低的初级编辑效率,但仍然看到了比cas9启动的HDR更高的期望编辑插入副产物的比例。

接下来的主要剪辑是什么?

虽然初始编辑是迈向更多功能基因组编辑的令人兴奋的一步,但在这一点上它是新的,并保证了许多额外的研究。在他们的论文中,Liu实验室指出,需要以全基因组的方式调查偏离目标的启动编辑,确定启动编辑器可能对细胞产生的任何意外影响,并进行评估在体外在活的有机体内交付策略。看到Twitter上大量关于prime编辑的讨论(在这里,在这里,在这里),我们也很期待接下来的精彩剪辑。

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参考文献

Anzalone, Andrew V.等。“无需双链断裂或供体DNA,就能进行基因组搜索和替换编辑。”自然(2019): 1 - 1。PubMedPMID: 31634902

Arezi Bahram和Holly Hogrefe。Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶的新突变通过与模板引物更紧密的结合增加了热稳定性。核酸研究37.2(2008):473-481。PubMedPMID: 19056821。公共医学中心PMCID: PMC2632894

Baranauskas, Aurimas等人。新型高耐高温加工M-MuLV逆转录酶变种的产生和鉴定蛋白质工程,设计与选择25.10(2012):657-668。PubMedPMID: 22691702

Komor, Alexis C,等。"基因组DNA中目标碱基的可编程编辑不需要双链DNA裂解"自然533.7603(2016): 420。PubMedPMID: 27096365。公共医学中心PMCID: PMC4873371

Rees, Holly A.和David R. Liu。碱基编辑:活细胞基因组和转录组的精确化学。《自然评论遗传学》19.12(2018):770-788。PubMedPMID: 30323312。公共医学中心PMCID: PMC6535181

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主题:CRISPR,中科院的蛋白质,CRISPR gRNAs,基本编辑

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